基因工程原理重组基因导入受体细胞优选ppt资料.ppt

基因工程原理重组(zhònɡzǔ)基因导入受体细胞基因工程(jīyīngōngchéng)原理DNA重组（限制性内切酶）运输工具——基因克隆载体目的基因的制备目的基因导入受体细胞外源基因的表达(biǎodá)基因工程的应用第五章重组(zhònɡzǔ)基因导入受体细胞第一节受体细胞1.原核受体细胞较为理想的受体细胞：大部分没有(méiyǒu)细胞壁，便于外源DNA进入没有(méiyǒu)核膜，染色体DNA没有(méiyǒu)固定结合的蛋白质基因组简单，不含线粒体、质体多为单细胞，容易获得一致性材料，易于扩大培养或发酵生长常用细菌：大肠杆菌。大肠杆菌(dàchánɡɡǎnjūn)。酵母菌表达系统的优势：结构最为简单的真核生物之一，基因表达调控(diàokònɡ)机理比较清楚，遗传操作简单培养简单遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长安全性高，无致病性，不会对外界环境造成污染具有较好的转译后加工机制，便于真核生物表达3.植物(zhíwù)受体细胞优点：真核细胞、细胞的全能性。4.动物细胞受体细胞包括：小鼠BHK细胞、中国仓鼠卵巢细胞CHO，猴肾细胞等受体动物：鼠、牛、羊、鱼等第二节重组(zhònɡzǔ)基因导入受体细胞转化（transformation）——重组质粒DNA分子(fēnzǐ)进入受体细胞，并在受体细胞稳定维持和表达的过程，转化后的受体菌，称转化子。（二）转导(zhuǎndǎo)D突变（三）转染（四）电激穿孔(chuānkǒng)（五）三亲本(qīnběn)杂交（triparentalmating）第十八页，。二、重组(zhònɡzǔ)基因导入植物受体细胞（Vir区）限制性酶切开（1）叶盘法转化植物(zhíwù)细胞（2）整体(zhěngtǐ)植株接种转化法（3）原生质体共培养转化(zhuǎnhuà)法（4）悬浮细胞(xìbāo)共培养转化法（二）植物病毒介导基因(jīyīn)转移（三）化学(huàxué)诱导DNA直接转化（2）脂质体介导基因(jīyīn)转化第二十九页，。（四）物理(wùlǐ)方法介导DNA直接转化（2）超声波介导转化(zhuǎnhuà)（4）显微(xiǎnwēi)注射第三十三页，。三、重组(zhònɡzǔ)基因导入动物受体细胞（二）脂质体介导转化(zhuǎnhuà)（三）动物病毒(bìngdú)介导转导法第三节重组(zhònɡzǔ)子筛选克隆子的筛选：经过各种方法将外源DNA分子(fēnzǐ)导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选（Screening）或选择(Selection)。一、遗传表型直接(zhíjiē)筛选一、遗传(yíchuán)表型直接筛选2.插入(chārù)失活筛选3.插入(chārù)表达筛选。第四十五页，。IPTGIPTG：异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷显色剂：X-gal，5-溴-4-氯-3-吲哚(yǐnduǒ)-β-D-半乳糖苷，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。（2）DNA分子转化感受态细胞FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→（染色体显带）→荧光显微镜检测→结果分析。氨苄青霉素抗药性B.第九十二页，。(c)DNA聚合酶Ⅲ，RNA(d)DNA聚合酶Ⅲ，DNAα－互补法（蓝白斑(báibān)筛选法）多为单细胞，容易获得一致性材料，易于扩大培养或发酵生长insituhybridization：组织原位杂交（二）免疫沉淀测定法（Immunoprecipitation,IP）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞。（1）基因枪转化(zhuǎnhuà)Ca2+诱导(yòudǎo)大肠杆菌转化法第六十八页，。DNA重组（限制性内切酶）杂交选择(xuǎnzé)转译检测法第三十三页，。（二）利用报告基因筛选植物(zhíwù)转化细胞荧光素酶（LUC）基因(jīyīn)GFP：绿色(lǜsè)荧光蛋白GFP标记(biāojì)的微管（三）利用(lìyòng)遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞（四）营养(yíngyǎng)缺陷型检测法（五）形成(xíngchéng)噬菌斑筛选法二、依赖于重组(zhònɡzǔ)子结构特征分析筛选三、核酸杂交(zájiāo)分析常见的分子(fēnzǐ)杂交：（一）分子探针(Molecularprobe)：是指具有同特异性目标分子产生很强的相互作用并可对其相互作用的产物进行(jìnxíng)有效检测的DNA分子、RNA分子和蛋白质。2.非放射性探针(tànzhēn)（藻红素(hónɡsù)）（2）地高辛标记(biāojì)探针：地高辛与UTP中尿嘧啶的C5相连第六十三页，。（3）荧光素标记探针：用荧光素标记核酸(hésuān)、抗生物素蛋白或抗地高辛抗体。3.标记探针(tànzhēn)的方法（2）随机(suíjī)引物标记法（3）