蛋白质的通性纯化和表征.pptx

蛋白质的通性纯化和表征一.蛋白质酸碱性质各个解离基团pK值与游离氨基酸不完全相同。短肽等电点和净电荷量能够依据pK值计算，蛋白质等电点要用等电聚焦等方法测定。二.蛋白质分子大小与形状（一）依据化学组成测定最低相对分子质量假定某种微量成份只有一个，测出其百分含量后，可用百分比式算出最低相对分子质量。若测出两种微量成份百分含量，分别用百分比式算出最低相对分子质量不相同时，可计算两个最低相对分子质量近似最小公倍数。例题：一个纯酶含亮氨酸（Mr131）1.65%，含异亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相对分子质量。解：按照Leu百分含量计算，最低MrX1：X1=(100131)/1.65=7939.4按照Ile百分含量计算最低MrX2：X2=(100131)/2.48=5282.3因为X1和X2数字差异较大，提醒这种酶含Leu和Ile不止1个，为了估算Leu和Ile个数，首先计算：X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5这种酶含任何氨基酸个数均应是整数，说明该酶最少含有2个Leu，3个Ile，其最低相对分子质量为：7939.42=15878.8或5282.3×3=15846.9（二）渗透压法测定相对分子质量（三）沉降分析法测定相对分子质量基础原理：⒈离心力（centrifugalforce，Fc）：当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“Fc”由下式定义：F=m·a=m·ω2ra—粒子旋转加速度，m—沉降粒子有效质量，ω—粒子旋转角速度，r—粒子旋转半径(cm)。⒉相对离心力（relativecentrifugalforce，RCF）:因为各种离心机转子半径或者离心管至旋转轴中心距离不一样，离心力而受改变，所以在文件中常见“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品能够在不一样离心机上取得相同结果。RCF就是实际离心场转化为重力加速度倍数。X为离心转子半径距离，以cm为单位；g为地球重力加速度（980cm/sec2）；n为转子每分钟转数（revolutionsperminute,简写成r/min,或rpm）。⒊沉降系数（sedimentationcoefficient，s）：1924年Svedberg对沉降系数下定义为颗粒在单位离心力场中移动速度。n若ω用2πn/60表示，则n⒋沉降速度（sedimentationvelocity）：对于球形颗粒Fc=1/6d3(ρp−ρm)ω2XFf=3dv当Fc=Ff时1/6d3(ρp−ρm)ω2X=3ηdvv=(1/18η)[d2(ρp−ρm)ω2X]Fc：离心力；Ff：摩擦力：d：球形粒子直径；η：流体介质粘度；ρP：粒子密度；ρm：介质密度；v：粒子移动速度从上式可知，粒子沉降速度与粒子直径平方、粒子密度和介质密度之差成正比；离心力场增大，粒子沉降速度也增加，将此式代入上项沉降系数公式中，则S也可表示为：①当ρP＞ρm，则S＞0，粒子顺着离心方向沉降。②当ρP＝ρm，则S＝0，粒子抵达某一位置后抵达平衡。③当ρP＜ρm，则S＜0，粒子逆着离心方向上浮。5.沉降系数与物质相对分子质量:依据Svedberg公式，由沉降系数能够计算出物质相对分子质量：Mr=RTS20,W/[D20,W(1-γρ)]Mr:相对分子质量；D20,W：以20℃水为介质时颗粒扩散系数；R:气体常数；T：绝对温度；S20,W：以20℃水为介质时颗粒沉降系数；γ：偏比容，等于溶质粒子密度倒数；ρ：溶剂密度6.沉降时间（sedimentationtime，Ts）:在实际工作中，经常碰到要求在已经有离心机上把某一个溶质从溶液中全部沉降分离出来问题，这就必须首先知道用多大转速与多长时间可到达目标。假如转速已知，则需处理沉降时间来确定分离某粒子所需时间。依据沉降系数定义可得积分得X2:离心转轴至离心管底内壁距离；X1:离心转轴至样品溶液面之间距离，那么（t2－t1）用Ts表示：7.K系数（kfactor）:K系数是用来描述在一个转子中，将粒子沉降下来效率。也就是使溶液澄清一个指数，所以也叫“cleaningfactor”。标准上，K系数愈小将粒子沉降速度愈快。由其公式可知，K系数与离心转速及粒子沉降路径相关。所以K系数是一个变数。通常，离心机转子说明书中提供K系数，都是依据最大路径及在最大转速下所计算出来数值。利用此公式预估离心时间，对水平式转子最适合；对固定角式转子而言，实际时间将比预估时间来得快些。蛋白质的通性纯化和表征（四）凝胶过滤法测定相对分子质量当含有各种组分样品流经凝胶层析柱时，大分子物质因为分子直径大，不易进入凝胶颗粒微孔，沿凝胶颗粒间隙以较快速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒微孔中，向下移动速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质