蛋白质分分离纯化和表征.ppt

等电点（pI）:在特定pH条件下，某种蛋白质分子所带正负电荷相等，静电荷为零，这一pH称为该蛋白质的等电点（pI）。
等电pH并不是一个恒定的值，它会因溶液中盐的种类和离子强度的影响而有所不同。

等离子点(isoionicpiont):蛋白质在纯水溶液中的带电状态则没有其他离子干扰，完全由H+的解离和结合来决定，这种条件下的等电点称为等离子点。等离子点是蛋白质的特征性常数。

二、蛋白质的分子大小与分子量的测定（一）根据化学组成测定最低相对分子量

用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原子，则可由此计算出蛋白质的最低分子量。

例：肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为0.335%,计
算二者的相对分子质量。

最低相对分子量＝x100=（二）渗透压法测定相对分子量（三）沉降分析测定Mr（四）凝胶过滤法测定Mr（五）SDS-PAGE法测定Mr聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）1．蛋白质胶体溶液的稳定性

蛋白质颗粒大小属于胶体粒子的范围(1-100nm)。又由于其分子表面有许多极性基团，亲水性极强，易溶于水成为稳定的亲水胶体溶液。
蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个因素：
双电层
水化层

a.丁达尔效应b.布朗运动c.不能透过半透膜2．蛋白质的沉淀

蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的，相对的。假若改变环境条件，破坏其水化膜和双电层，蛋白质亲水胶体便失去稳定性，发生絮结沉淀现象，这既是所谓的蛋白质沉淀作用。

①盐析法（saltingout）：
中性盐（NH4SO4，NaSO4，NaCl等）→蛋白
质脱去水化层。优点：不引起蛋白质变性。

盐溶（saltingin）：稀盐溶液中蛋白质溶解度增
加的现象。②有机溶剂沉淀法：
极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）→脱去水
化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相
互作用。条件：低温操作，缩短时间。
③重金属盐沉淀法：当溶液pH>pI,蛋白质颗粒带负电荷,易与重金属离子
(Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等)→生成沉淀。
④生物碱试剂和某些酸类沉淀法：生物碱试剂—能引起生物碱沉淀的一类试剂。当溶
液pH<pI时,蛋白质颗粒带正电荷→易与生物碱试剂,
酸根负离子反应→沉淀用途：临床除去体液中干扰测定的蛋白质⑤加热变性测定法1.定义：
在某些物理或化学因素作用下，天然蛋白质严密的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生物学活性的丧失（如酶失去催化活力，激素丧失活性），则称之为蛋白质变性作用(denaturation)。
有些蛋白质的变性是可逆的，通过适当的方法（如透析）将变性剂除去后，蛋白质可以恢复其天然立体结构，这个过程称为复性（renaturation）。

一般认为蛋白质变性本质是次级键的破坏，只有空间构象的改变，并不涉及一级结构（共价键）的变化。第十五页，共三十六页。化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐、
生物碱试剂、尿素等旋光值改变
特性粘度增加
溶解度降低
扩散系数降低
结晶能力丧失
易于沉淀，若加热还会凝固。但若远离等电点
则不一定沉淀
变性后蛋白质肽键暴露而更加易于消化变性蛋白质为什么能复性？五、蛋白质分离纯化的一般原则六、蛋白质的分离纯化方法凝胶过滤法（二）利用溶解度差别的纯化方法
盐析：当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析。

有机溶剂分级分离法：引起蛋白质沉淀的主要原因是改变了介质的介电常数。

温度对蛋白质溶解度的影响：0-40℃之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度的升高而增加。
（三）根据电荷不同的纯化方法

电泳：在外电场的作用下，带电颗粒向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。

原则上按电泳的原理来分，可分为：

自由界面电
区带电泳CH2=CH聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）第二十九页，共三十六页。此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。

若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。

若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。

物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。
第三十一页，共三十六页。（六）亲和层析七、蛋白质的含量测定与纯度1.双缩脲法2.福林－酚法