一种提取质粒的试剂和方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号(10)授权公告号CN103173438B(45)授权公告日(45)授权公告日2015.03.04(21)申请号201310125084.7(22)申请日2013.04.10(73)专利权人杭州百迈生物技术有限公司地址310007浙江省杭州市西湖区西溪路525号浙大科技园A东628室(72)发明人林源吉吕航(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)审查员韦炜权利要求书2页说明书8页序列表1页附图1页(54)发明名称一种提取质粒的试剂和方法(57)摘要本发明提供了一种提取质粒的试剂和方法，它包括细菌裂解液、内毒素去除颗粒溶液、内毒素去除液、质粒结合液、洗涤液和洗脱液等试剂。利用本发明所述试剂和方法提取质粒，其操作步骤简单，提取所消耗的时间短，能有效降低所提取质粒中的内毒素含量，所提取的质粒中内毒素的含量可降至0.1EU/μg以下，符合临床标准，获得的质粒DNA产量高，纯度好。CN103173438BCN103173438B权利要求书1/2页1.一种提取质粒DNA的试剂，其特征在于包括：细胞悬浮液、细胞裂解液、缓冲液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液、质粒结合液和内毒素去除颗粒溶液，其中：细胞悬浮液包括2mmol/LKH2PO4，10mmol/LNa2HPO4·12H2O，137mmol/LNaCl，2.7mmol/LKCl，1％Tween20，pH6.0-8.0，使用前加入RNaseA并混合均匀，4℃贮存，以超纯水为溶剂；细胞裂解液包括0.1-2.5mol/LNaOH，质量体积百分比为0.05％-1％的SDS，以超纯水为溶剂，室温密闭贮存；缓冲液包括0.1-0.5mol/L(NH4)2HPO4·NH4H2PO4，0.5-3mol/LKCl，pH3-5，以超纯水为溶剂，室温密闭贮存；洗涤液1包括2-8MGuHCl，200mmol/LTris，2MEDTA，1.5mol/LNaCl，pH6.8-7.0，以超纯水为溶剂，室温密闭贮存；洗涤液2包括50-100％乙醇；洗脱液为dH2O；内毒素去除颗粒溶液包括10mg/ml能与内毒素特异性结合的复合颗粒，含有0.02％叠氮钠的20mMTris-HCl，pH为7.5；所述复合颗粒包括能与内毒素特异性结合的特异性结合物和用于承载该特异性结合物的载体，所述特异性结合物选自能特异性结合内毒素的多克隆抗体、或单克隆抗体、或多克隆抗体和单克隆抗体的混合物；质粒结合液包括2-8MGuHCl，10-50mMHEPES，pH6.8-8.2，以超纯水为溶剂。2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述载体选自琼脂糖凝胶颗粒、磁珠颗粒、乳胶颗粒或胶体金颗粒。3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述特异性结合物和载体之间以1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺或N-羟基琥珀酼亚胺作为偶联剂。4.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，还包括内毒素去除液，所述内毒去除溶液包括2-85mMTris，0.5-10％TritonX-114，pH8.0，以超纯水为溶剂。5.一种利用权利要求1至4之一所述的试剂提取质粒DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取2-4ml在培养基中培养8-16小时的菌液，12,000×g离心1分钟，弃尽上清；(2)加250μl细胞悬浮液以悬浮步骤1中的细菌，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；(3)向步骤2的细胞悬浮液中加入250μl细胞裂解液，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，操作时间不超过5分钟；(4)向步骤3中的透亮溶液中加350μl缓冲液，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12,000×g离心10分钟；(5)吸取步骤4中的离心上清并转移到质粒提取制备管，12,000×g离心1分钟，弃滤液；(6)将制备管置回离心管，加500μl洗涤液1，12,000×g离心1分钟，弃滤液；(7)将制备管置回离心管，加700μl洗涤液2，12,000×g离心1分钟，弃滤液；再次加入700μl洗涤液2洗涤一次，12,000×g离心1分钟，弃滤液；(8)将制备管置回2ml离心管中，12,000×g离心1分钟；2CN103173438B权利要求书2/2页(9)将制备管移入新的1.5ml离心管中，在制备管中央加150μl洗脱液，室温静置1分钟，12,000×g离心1分钟；(10)弃制备管，往离心管中加入内毒素去除颗粒溶液50μl，颠倒混匀5分钟，1,000×g离心20秒；(11)小心吸取上清液150μl至一干净离心管中，加入质粒结合液300μl，混合均匀；(12)将步骤11的混合液加入至一无内毒素制备管中，12,000×g离心1分钟；(13)将制备管置回离心管，加700μl洗涤液2，1