一种提取质粒DNA的试剂和方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103882007103882007A(43)申请公布日2014.06.25(21)申请号201210563585.9(22)申请日2012.12.24(71)申请人苏州中同生物科技有限公司地址215101江苏省苏州市吴中区木渎镇金枫南路198号同济大学苏州研究院2号楼4楼(72)发明人杨艳菊何胜祥(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)C12R1/19(2006.01)权权利要求书1页利要求书1页说明书3页说明书3页附图1页附图1页(54)发明名称一种提取质粒DNA的试剂和方法(57)摘要本发明公开了一种提取质粒DNA的试剂和方法，它包括菌体裂解试剂、蛋白质抽提试剂、质粒DNA沉淀试剂和质粒DNA溶解试剂。用本发明所述提取质粒的方法提取质粒操作时间短，提取质粒平均时间为8分钟；本发明所用提取质粒的试剂组成简单，均为常见实验试剂，来源广泛且价格低，各组分均可以采用国产分析纯就可以提取到高产量和纯度的质粒，大大降低了费用；获得的质粒DNA产量高，纯庋好，无杂蛋白和RNA的污染，提取到的质粒DNA可以直接用于酶切、连接、测序、原核转化和真核转染等实验，大大方便了生物实验操作，节省了实验时间，提高了实验效率。CN103882007ACN103827ACN103882007A权利要求书1/1页1.一种提取质粒DNA的试剂，其特征在于它包括菌体裂解试剂、蛋白质抽提试剂、质粒DNA沉淀试剂和质粒DNA溶解试剂；所述菌体裂解试剂的组分为：10mMTris-HCl、1mMEDTA、150mM氯化钠和5mg/ml溶菌酶，以超纯水为溶剂，所述Tris-HCl的PH值为7.5-7.8；所述蛋白质抽提试剂的组分为酚和氯仿的体积比为1∶1的混合物；所述质粒DNA沉淀试剂的组分是PH为7.5的5.5M醋酸钠溶液和无水乙醇，其中醋酸钠溶液和无水乙醇体积比为1∶4；所述质粒DNA溶解试剂的组分为含有0.15mg/mlRNase的超纯水。2.一种根据权利要求1所述的试剂提取质粒DNA的方法，其特征在于它包括以下步骤：(1)摇菌扩增质粒；将携带质粒的大肠杆菌接种于LB固体培养基中，挑选单克隆菌落接种于LB液体培养基扩增培养，置于在30-37.5℃恒温摇床上培养，摇床转速为200-250转/分钟；(2)取培养12-15小时OD600达到0.5～0.6之间的生长状态良好的细菌菌液1.5ml于1.5ml离心管，室温下以12000g离心30秒，弃上清；(3)沉淀中加入100μl所述菌体裂解试剂，充分振荡混匀；(4)加入100μl所述蛋白抽提试剂，置于涡旋振荡仪上混匀5秒钟；(5)室温下以12000g离心5分钟以释放质粒DNA；(6)收集上清，切勿触动蛋白质界面；(7)加入20μl质粒DNA沉淀试剂和200μl的无水乙醇，颠倒混匀；(8)室温下以12000g离心1分钟以沉淀质粒DNA；(9)弃上清，并干燥质粒DNA；(10)用50μl质粒DNA溶解试剂溶解质粒DNA，-20℃保存备用。2CN103882007A说明书1/3页一种提取质粒DNA的试剂和方法技术领域[0001]本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种提取质粒DNA的试剂和方法。背景技术[0002]质粒DNA是基因工程常用的载体，可以携带外源基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达，质粒DNA的提取和纯化是分子生物学研究领域中应用最广泛和最基本的技术，质粒提取的效率和质量对于后续实验(酶切、PCR扩增和测序等)的成功与否有着直接的关系。目前在国内外，很多生物试剂公司都研制了与提取质粒技术相关的试剂盒，如普洛麦格(promega)、碧云天、生工等。该类试剂盒多以纯化柱为主，成本高，价格昂贵，试剂繁杂且耗时较长。若以改良的碱裂解、酚—氯仿抽提方法提取质粒，获得的质粒DNA产量低，质量不高，不能满足下游的酶切和测序的要求，同时多种试剂混合应用，无疑加大了实验的工作量，使得实验时间显著延长，影响生物学实验操作和实验结果。发明内容[0003]本发明解决了以上不足，提供了一种提取质粒DNA的试剂和方法，本发明所用提取质粒的试剂成本低，提取质粒DNA的方法操作简单，且本发明所述的试剂和方法提取出的质粒产量高、纯度高，本发明具有快速、高效、高质且成本低的优点。[0004]为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案：[0005]一种提取质粒DNA的试剂，其特征在于它包括菌体裂解试剂、蛋白抽提试剂、质粒DNA沉淀试剂和质粒DNA溶解试剂；所述菌体裂解试剂的组分为：10mMTris-HCl、1mMEDTA、150mM氯化钠和5mg/ml溶菌酶，以超纯水为溶剂，所述Tris-HCl的PH值为7.5-7.8；所述蛋白