用于检测耐药性结核分枝杆菌的组合物和方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107002146A(43)申请公布日2017.08.01(21)申请号201580067201.6(74)专利代理机构中国专利代理(香港)有限公司720(22)申请日2015.12.1801代理人杜艳玲黄希贵(30)优先权数据14/5758792014.12.18US(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日2017.06.09(86)PCT国际申请的申请数据PCT/EP2015/0804842015.12.18(87)PCT国际申请的公布数据WO2016/097291EN2016.06.23(71)申请人豪夫迈·罗氏有限公司地址瑞士巴塞尔(72)发明人J.A.约翰逊R.梅塔A.袁权利要求书2页说明书22页序列表125页附图8页(54)发明名称用于检测耐药性结核分枝杆菌的组合物和方法(57)摘要描述了用于快速检测生物或非生物样品中是否存在对利福平耐受的结核分枝杆菌(MTB)(MTB-RIF)和/或对异烟肼耐受的MTB(MTB-INH)的方法。所述方法可包括进行扩增步骤、杂交步骤和检测步骤。此外，提供了经设计用于检测MTB-RIF和/或MTB-INH的靶向rpoB、inhA和katG基因的引物、探针，连同试剂盒。CN107002146ACN107002146A权利要求书1/2页1.检测样品中对利福平耐受的结核分枝杆菌(MTB)(MTB-RIF)和/或对异烟肼耐受的MTB(MTB-INH)的方法，所述方法包括：-进行扩增步骤，其包括使所述样品与至少一组rpoB引物、一组inhA引物和一组katG引物接触，从而，如果所述样品中存在任何rpoB、inhA和katG靶核酸，则产生一种或多种扩增产物；-进行杂交步骤，其包括使所述一种或多种扩增产物与多种可检测的rpoB探针、多种可检测的inhA探针和多种可检测的katG探针接触，所述探针至少包括：-17种rpoB探针，其用于检测赋予MTB利福平抗性的17种单核苷酸多态性SNP中的一种或多种；-3种inhA探针，其用于检测赋予MTB异烟肼抗性的3种SNP中的一种或多种；和-4种katG探针，其用于检测赋予MTB异烟肼抗性的4种SNP中的一种或多种；以及-检测是否存在所述一种或多种扩增产物，其中存在所述一种或多种扩增产物表明所述样品中存在MTB-RIF和/或MTB-INH，并且其中不存在所述一种或多种扩增产物表明所述样品中不存在MTB-RIF和/或MTB-INH；其中所述多种rpoB探针包括用于检测赋予MTB利福平抗性的17种SNP中的每一种的水解探针，所述SNP包括：rpoB531L、rpoB531W、rpoB526L、rpoB526Y、rpoB526D、rpoB526N、rpoB513L、rpoB513K、rpoB513P、rpoB522L、rpoB522Q、rpoB522W、rpoB516V、rpoB516Y、rpoB533P、rpoB511P和rpoB526R；其中所述多种inhA探针包括用于检测赋予MTB异烟肼抗性的3种SNP中的每一种的水解探针，所述SNP包括：inhA-15T、inhA-8A和inhA-8C；并且其中所述多种katG探针包括用于检测赋予MTB异烟肼抗性的4种SNP中的每一种的水解探针，所述SNP包括：katG315I、katG315N、katG315T和katG315T2。2.根据权利要求1的方法，其中：-所述rpoB探针包含选自SEQIDNO:1-289和437-438的核酸序列或其互补物；-所述inhA探针包含选自SEQIDNO:344-409和436的核酸序列或其互补物；并且-所述katG探针包含选自SEQIDNO:290-343和434-435的核酸序列或其互补物。3.根据权利要求1和2中任一项的方法，其中所述多种可检测的rpoB、inhA和katG探针中的每一种均用供体荧光部分和对应的受体荧光部分标记；并且其中所述检测步骤包括检测一种或几种的所述rpoB、inhA和katG探针的所述供体荧光部分与所述受体荧光部分之间是否存在荧光共振能量转移(FRET)，其中荧光发射的存在与否表明所述样品中是否存在MTB-RIF和/或MTB-INH。4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述扩增采用具有5'至3'核酸酶活性的聚合酶。5.根据权利要求3和4中任一项的方法，其中所述供体和受体荧光部分在所述探针上彼此相距不超过8个核苷酸。6.根据权利要求3至5中任一项的方法，其中所述受体荧光部分为猝灭剂。7.用于检测对利福平耐受的结核分枝杆菌(MTB)(MTB-RIF)和/或对异烟肼耐受的MTB(MTB-INH)的核酸的试剂盒，包括：-专门用于扩