BRAF基因V600E突变的荧光定量检测引物和探针.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107090512A(43)申请公布日2017.08.25(21)申请号201710499418.5(22)申请日2017.06.27(71)申请人迈基诺（重庆）基因科技有限责任公司地址400000重庆市江北区港城东环路6号银联都市工业园1幢1-2，2-2，3-2，4-2，5-2，6-2号(72)发明人伍建姬晓雯冯越任爽华(74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅张立娜(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表1页附图2页(54)发明名称BRAF基因V600E突变的荧光定量检测引物和探针(57)摘要本发明公开了一种BRAF基因V600E突变的荧光定量检测引物和探针。本发明所提供的BRAF基因V600E突变的荧光定量检测引物为引物1和引物2，所述引物1为序列表中序列1所示的单链DNA，所述引物2为序列表中序列2所示的单链DNA；探针为序列表中序列3所示的单链DNA探针。针对组织样本DNA和FFPE石蜡切片，本发明可以进行最低50ngDNA、突变率最低0.5％的检测，并且最终的荧光曲线Ct值≤36，说明本发明所提供的引物对和探针具有很好的灵敏度。本发明对于筛查BRAF基因V600E突变相关癌症具有重要意义。CN107090512ACN107090512A权利要求书1/1页1.用于检测BRAF基因V600E突变的组合物，由一个引物对和一个探针组成；所述引物对由引物1和引物2组成，所述引物1为序列表中序列1所示的单链DNA，所述引物2为序列表中序列2所示的单链DNA；所述探针为序列表中序列3所示的单链DNA探针。2.用于检测BRAF基因V600E突变的引物对，其特征在于：所述引物对由引物1和引物2组成，所述引物1为序列表中序列1所示的单链DNA，所述引物2为序列表中序列2所示的单链DNA。3.用于检测BRAF基因V600E突变的探针，其特征在于：所述探针为序列表中序列3所示的单链DNA探针。4.根据权利要求1所述的组合物或权利要求3所述的探针，其特征在于：所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。5.根据权利要求1、3或4所述的组合物或探针，其特征在于：所述荧光基团为FAM；所述淬灭基团为BHQ1。6.用于检测BRAF基因V600E突变的试剂盒，含有下述a)和b)：a)权利要求1-5中任一所述的组合物或引物或探针；b)阴性引物；所述阴性引物为序列表中序列4所示的单链DNA。7.根据权利要求1-7中任一所述的组合物或试剂盒，其特征在于：所述引物1、所述引物2和所述探针的摩尔比为1：1：1；或所述引物1、所述引物2、所述阴性引物和所述探针的摩尔比为1：1：1：1。8.权利要求1-5中任一所述的组合物或引物或探针在制备权利要求6所述的试剂盒中的应用。9.权利要求1-7中任一所述的组合物或引物或探针或试剂盒在制备用于筛查BRAF基因V600E突变相关癌症的产品中的应用。10.权利要求1-7中任一所述的组合物或引物或探针或试剂盒和记载有“检测BRAF基因V600E突变方法”的可读性载体在制备用于筛查BRAF基因V600E突变相关癌症的产品中的应用；所述检测BRAF基因V600E突变方法，包括如下步骤：用权利要求1-7中任一所述的组合物或引物或探针或试剂盒对待测样品进行Taqman探针荧光定量RT-PCR反应；进行所述Taqman探针荧光定量RT-PCR反应时，反应体系中所述引物1和所述引物2的浓度为500nM，所述探针的浓度为500nM。2CN107090512A说明书1/4页BRAF基因V600E突变的荧光定量检测引物和探针技术领域[0001]本发明属于生物医学领域，涉及一种BRAF基因V600E突变的荧光定量检测引物和探针。背景技术[0002]BRAF基因位于染色体臂7q34上。它编码B-raf，丝氨酸-苏氨酸激酶是Ras-Raf-Mek-Erk-MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)信号级联的一部分。该途径的激活涉及促进细胞的生长，增殖和分化。[0003]人体中存在三种功能性RAF蛋白，即ARAF、BRAF和CRAF。其中，BRAF具有最高的基础激酶活性，是MAPK通路最有效的激活剂。[0004]BRAF基因由18个外显子组成，最常见的活化突变在1799位核苷酸的外显子15中发现，涉及将胸腺嘧啶转换为腺嘌呤。这导致在位置600的谷氨酸取代缬氨酸，其被指定为V600E。该突变发生在B-raf蛋白的激酶结构域内，据报道其激酶活性高于其正常对应物的10倍。因此，它作为癌基因，促进细胞生长，分化和生存。[0005]已经鉴定了30多种不同的BRAF突变。然而，V6