一株杀菌固氮荧光假单胞菌及其发酵方法与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107557326A(43)申请公布日2018.01.09(21)申请号201711027268.4A01P3/00(2006.01)(22)申请日2017.10.27A01P7/04(2006.01)A01P21/00(2006.01)(83)生物保藏信息C12R1/39(2006.01)CGMCCNo.144762017.07.31(71)申请人山东大学地址250100山东省济南市山大南路27号申请人德州迈科生物技术有限公司(72)发明人张友明涂强于芳楠荆晓姝(74)专利代理机构北京中济纬天专利代理有限公司11429代理人张祥明(51)Int.Cl.C12N1/20(2006.01)A01N63/00(2006.01)A01P1/00(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图4页(54)发明名称一株杀菌固氮荧光假单胞菌及其发酵方法与应用(57)摘要本发明公开了一株杀菌固氮荧光假单胞菌(PseudomonasprotegensCHA0)突变菌株CHA0-△retS-NiFCGMCCNo.14476及其发酵方法与应用。其最优培养条件为pH＝7，温度28℃，转速600rpm。还公开了一种以荧光假单胞菌突变菌株CHA0-△retS-NiF为活性成分的微生物菌剂，对突变菌株进行扩大培养，菌体进入稳定期，细胞密度达到最大值时进行离心，对离心后的菌体进行冷冻干燥，即得，菌体干重为15.9g(DCW/L)。本发明的突变菌株CHA0-△retS-NiF固氮、杀菌能力强，在防治植物病害及促进植物生长方面具有广阔应用前景，具有产业化的可能性。CN107557326ACN107557326A权利要求书1/1页1.荧光假单胞菌(PseudomonasprotegensCHA0)突变菌株为CHA0-△retS-NiF，其保藏编号为：CGMCCNo.14476。2.荧光假单胞菌(PseudomonasprotegensCHA0)突变菌株CHA0-△retS-NiF的发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)种子活化：从-80℃超低温冷冻存储箱中取出含有CHA0-△retS-NiF菌种的甘油管，待解冻后取少量菌液划线于LB+genta20平板上，于30℃恒温生化培养箱中倒置培养20小时，从平板上随机挑选5个单菌落进行菌落PCR验证以确保获得正确的目的菌株；(2)摇瓶种子培养：将活化好的CHA0-△retS-NiF菌种接入KB培养基中，放置在全温振荡培养箱中培养20小时，得到种子液；(3)发酵罐培养：将种子液接种到装有KB培养基发酵罐中，接种量为5～10％，即每100mlKB培养基加入5～10ml种子液，接种完毕后进行通气量，溶氧，温度，转速，pH设置，每隔6小时取菌液测定细胞密度，发酵周期为96小时。3.根据权利要求2所述的发酵培养方法，其特征在于，步骤(2)与步骤(3)所述KB培养基的配方为：每1000mL水中含甘油10mL，蛋白胨20g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O1.5g。4.根据权利要求2所述的发酵培养方法，其特征在于，步骤(2)中培养条件为30℃，200rpm。5.根据权利要求2所述的发酵培养方法，其特征在于，步骤(3)所述发酵罐培养条件为：温度为26～32℃，pH为6～7.5，转速为300～600rpm，通气量为0.8～4.0L/min，溶氧0.8～1.0L/min，溶氧不与转速串联，培养12～24小时后流加25～100mL的质量分数为50％葡萄糖水溶液，此后每间隔2～6小时流加一次25～100mL的50％葡萄糖水溶液，直到发酵结束，期间用体积比为20％磷酸，氨水维持pH的稳定，体积比50％消泡剂进行消泡。6.根据权利要求5所述的发酵培养方法，其特征在于，步骤(3)所述发酵培养条件为：温度为28℃，pH为7，转速为600rpm。7.一种以荧光假单胞菌(PseudomonasprotegensCHA0)突变菌株CHA0-△retS-NiF为活性成分的微生物菌剂。8.根据权利要求7所述的微生物菌剂，其特征在于，其制备方法为：步骤(3)所述发酵罐培养的菌体进入稳定期，细胞密度达到最大值时进行离心，冷冻干燥后收集菌体，即得。9.权利要求1所述荧光假单胞菌突变菌株CHA0-△retS-NiF在杀菌固氮、促进植物生长方面的应用。2CN107557326A说明书1/6页一株杀菌固氮荧光假单胞菌及其发酵方法与应用技术领域[0001]本发明涉及一株杀菌固氮荧光假单胞菌及其发酵方法与应用，尤其涉及其在生物防治中的应用。本发明属于生物技术领域。背景技术[0002]荧光假单胞菌(Pseudomonasprotegens)是一种植物生防菌，能分泌多种活性物质，在抗细菌、