用于功能分析多特异性分子的基于SPR的双重结合测定法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109791149A(43)申请公布日2019.05.21(21)申请号201780060075.0(74)专利代理机构北京市中咨律师事务所(22)申请日2017.09.2111247代理人陈迎春黄革生(30)优先权数据16191712.52016.09.30EP(51)Int.Cl.G01N33/543(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日G01N33/68(2006.01)2019.03.28(86)PCT国际申请的申请数据PCT/EP2017/0738482017.09.21(87)PCT国际申请的公布数据WO2018/060035EN2018.04.05(71)申请人豪夫迈·罗氏有限公司地址瑞士巴塞尔(72)发明人C·加斯纳W·梅舍德费尔J·莫莱肯权利要求书2页说明书12页附图3页(54)发明名称用于功能分析多特异性分子的基于SPR的双重结合测定法(57)摘要本文报道了测定抗体与第一和第二抗原结合的方法，所述抗体包含特异性结合所述第一抗原的第一结合位点和特异性结合所述第二抗原的第二结合位点，其中所述方法包括以下步骤：使用特异性结合抗体恒定结构域的捕获试剂将抗体捕获在固相上，孵育捕获的抗体与第一或第二抗原，以形成捕获的抗体-抗原复合物并测定第一结合信号，i)孵育捕获的抗体-抗原复合物与没用于形成捕获的抗体-抗原复合物的抗原，以形成捕获的抗体-抗原-抗原复合物并测定第二结合信号，或者ii)再生表面，使用特异性结合抗体恒定结构域的捕获试剂将抗体捕获在固相上，孵育捕获的抗体与没用于形成步骤b)中捕获的抗体-抗原复合物的抗原，以形成捕获的抗体-抗原-抗原复合物并测定第三结合信号，和测定来自第一结合信号和第二或第三结合信号的抗CN109791149A体与第一和第二抗原的总体或单独结合。CN109791149A权利要求书1/2页1.一种测定抗体与第一和第二抗原结合的方法，所述抗体包含特异性结合所述第一抗原的第一结合位点和特异性结合所述第二抗原的第二结合位点，其中所述方法包括以下步骤：a)使用特异性结合抗体恒定结构域的捕获试剂将抗体捕获在固相上，b)孵育捕获的抗体与第一或第二抗原，以形成捕获的抗体-抗原复合物并测定第一结合信号，c)孵育捕获的抗体-抗原复合物与没用于形成捕获的抗体-抗原复合物的抗原，以形成捕获的抗体-抗原-抗原复合物并测定第二结合信号，或者再生表面，使用特异性结合抗体恒定结构域的捕获试剂将抗体捕获在固相上，孵育捕获的抗体与没用于形成步骤b)中捕获的抗体-抗原复合物的抗原，以形成捕获的抗体-抗原复合物并测定第三结合信号，和d)测定来自第一结合信号和第二或第三结合信号的抗体与第一和第二抗原的总体或单独结合。2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤d)是d)如果i)捕获的抗体-抗原复合物的形成获得第一结合信号，和ii)捕获的抗体-抗原-抗原复合物的形成、或者再生后捕获的抗体-抗原复合物的形成获得相对于第一结合信号增加的第二或第三结合信号，则测定抗体与第一和第二抗原的总体或单独结合。3.一种测定抗体与第一和第二抗原总体和单独结合的方法，所述抗体包含特异性结合所述第一抗原的第一结合位点和特异性结合所述第二抗原的第二结合位点，其中所述方法包括以下步骤：-使用特异性结合抗体恒定结构域的捕获试剂将抗体捕获在固相上，-孵育捕获的抗体与第一或第二抗原，以形成固定的抗体-抗原复合物，-孵育捕获的抗体-抗原复合物与没用于形成捕获的抗体-抗原复合物的抗原，以形成捕获的抗体-抗原-抗原复合物，和-如果捕获的抗体-抗原复合物的形成获得第一结合信号，和捕获的抗体-抗原-抗原复合物的形成获得相对于第一结合信号增加的第二结合信号，则测定抗体与第一和第二抗原的单独结合，并基于此还测定抗体与第一和第二抗原的总体结合。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述固相是表面等离子体共振芯片，所述第一结合信号是表面等离子体共振反应，所述第二结合信号是表面等离子体共振反应。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述抗体是双特异性抗体。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述双特异性抗体是CrossMab或DutaFab。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述捕获试剂是抗Fc区抗体或抗Fab抗体。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述抗Fab抗体是抗κ轻链抗体或抗λ轻链抗体。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述抗体是DutaFab，所述固相是表面2CN109791149A权利要求书2/2页等离子体共振芯片，所述捕获试剂是抗κ轻链抗体或抗λ轻链抗体，所述第一结合信号是表面等离子体共振反应，所述第二结合信号是表面等离子体共振反应。10.根据权利