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酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究————————————————————————————————作者:————————————————————————————————日期:酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究作者摘要关键词一．实验目的1.认识生物体中酶的存在和催化作用便于我们了解生物体系中酶存在下的合成或分解与普通的有机合成的不同和相同之处认识一些生物化学过程的特殊性。2.掌握生物活性物质的提取和保存方法学会使用仪器分析的手段研究催化反应特别是生物化学体系中催化过程的基本思想和方法。二．实验原理许多复杂的有机物合成与分解反应需要在高温、高强酸碱或减压等苛刻条件下才能进行而在生物体内即使在十分温和的条件下如常温、常压和近中性溶液中许多复杂的化学反应却能顺利进行其根本原因就是由于生物酶的存在。生物酶是一种生物催化剂按照它的组成可分为两类一类是简单蛋白质其活性取决于它的结构如脲酶、淀粉酶等;第二类的结合蛋白质酶它需要加入某些非蛋白质组分(称为辅助因子）后才能表现出酶的活性。酶蛋白质与辅助因子结合形成的复合物称为全酶。例如酪氨酸酶是以铜离子为辅助因子的全酶。通常反被酶作用的物质称为该酶的底物一种酶催化特定的一个或一类底物的反应具有很高的选择性和灵敏度因而引起广大分析工作者的重视和兴趣。酶已作为一种分析试剂得到应用。特别是有生化、医学方面有很高的应用价值。例如生命物质和流体中的特殊有机成分用其他方法测定有困难用酶法分析却有其独到之处。本实验从土豆中提取酪氨酸酶并测定其催化活性。当土豆、苹果、香焦等的受损面接触空气后会产生深棕色的现象是人们都见过的这是这类物质含有酪氨酸和酪氨酸酶酶存在于物质内部当暴露在空气中后在氧气的参与下会发生一系列反应。以下是主要的反应过程。由于多巴转变成多巴红的反应速率较快再转到下一步产物速率则慢得多故可选择多巴转变为多巴红的反应速率的测定来判断催化反应的活性。因多巴红具有特殊的颜色故可用分光光度法测定在不同的时刻测定某特定波长下的吸光度用吸光度对时间作图从所得的直线斜率求酶的活性。其反应过程如下图所示酶的活性计算方法:一般定义在优化的条件下(包括pH值、离子强度、温度等)２5℃时在1min内转化1mol底物所需要催化剂的量为活性单位。通过下式可计算酶的活性：Aa106式中a为所用溶液的酶的活性A为最大吸收波长吸光度的变化tktV为时间（min）k为多巴红的摩尔吸收系数V为加入酶的体积进而计算出原料(土豆）中酶的活性:AaV/m。式中A为原料中酶的活性(注意此处A不是吸光度A）V为o0原料所得的酶溶液的总体积m为原料总质量。三．实验仪器与试剂1、仪器：分光光度计、离心机、研钵、水浴、秒表2、试剂:二羟基苯丙胺酸(多巴)、磷酸二氢钠、氢氧化钠、盐酸、土豆四．实验步骤1.溶液配制０.1０ｍol/Ｌ磷酸缓冲溶液(ｐH=７.2)：50ml0.20mol／Ｌ磷酸二氢钠+8ml0.1moｌ／L盐酸定容至200ml;0.１0mol/L磷酸缓冲溶液(pH=6.0):50mｌ0.20mol/L磷酸二氢钠+22ｍｌ０．1ｍol/Ｌ盐酸定容至20０mｌ;0．１0mｏl/L多巴溶液：0.1９5g多巴用pH=６.0的磷酸缓冲溶液定容至１00ml（现用现配)。2酶的提取取新鲜土豆清洁后切碎称取10．0g置于研钵中加入7.５mLｐH=7.2的磷酸缓冲溶液用力挤压两层纱布滤出提取液立即离心分离(３000rpm５mｉｎ)倾出上层清液保存于冰浴中提取液为棕色在放置过程中不断变黑。3.酶的活性测量取２．５ml上述提取液用pH=7.2的缓冲溶液稀释到1０ml比色管中摇匀分别取0.1mＬ稀释过的提取液于１0ｍＬ比色管中加入２.5mLpH=６.0的缓冲溶液再加入2ml多巴溶液同时开始计时用分光光度计在4８0nm处测定吸光度。开始6mｉn内每分钟读一个数以后隔２mｉｎ读一个数直至吸光度变化不大为止。取0.2ml0.3mｌ。０.4mｌ已稀