荧光PCR检测原理.pdf

....实时荧光定量PCR技术是指在PCR反响体系中参加荧光染料或荧光基团利用荧光信号来实时监测整个PCR进程最后通过标准曲线对未知模板浓度进展定量分析。其特点有：(1)用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量进展实时动态连续的荧光监测防止终点定量的不准确性并且消除了标本和产物的污染且无复杂的产物后续处理过程。(2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA或荧光探针特异结合木得检测物等方法获得打打提高了检测的灵敏度、特异性和准确性。Real-timeO-PCR可以应用于mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以与病毒感染的定量监测。实时荧光定量PCR技术的根本原理在PCR反响体系中参加荧光染料或荧光基团这些荧光物质有其特定的波长。仪器可以自动检出利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程在PCR循环中测量的信号将作为荧光阈值的坐标。并且引入一个——Ct值〔Thresholdcycle〕概念Ct值是指产生可被检测到得荧光信号所需的最小循环数是在PCR循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号可以用于定义一个样本的Ct值。通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线然后计算相对方程式。方程式的斜度可以用来检查PCR的效率所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数〔R²＞0.99〕这样才能认为实验的过程和数据是可信的使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量。实时荧光定量PCR仪都有软件可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。实时荧光定量PCR技术的应用1.基因工程研究领域①基因表达研究：对β地中海贫血症患者β与γ珠蛋白mRNA水平进展检测其结果特异性强、定量准确为了解β地中海贫血的分子病理机制与其临床诊断提供了可靠的检测数据。②转基因研究：利用两种发光探针与适当的循环阈值扩增一个转移后的基因和一个对照基因以分析转基因老鼠接合性。该方法为45个转基因动物的同型结合与异质结合提供了明确的鉴定结果。通过实时定量PCR检测同型结合的异质接合动物交配后其子代中转基因的传递情况符合孟德尔遗传规律。这项技术在转基因动物繁育与基因剂量功能效应实验中将有很大的用途。1/5....③单核苷酸多态性〔SNP〕与突变分析：实时荧光定量PCR一个诱人的应用前景是用于检测基于两条探针和基因组的不稳定性。基因突变基于两条探针一条探针横跨突变点另一条为锚定探针与无突变位点的靶序列杂交。两条探针用两种不同的发光基团标记。如靶序列中无突变探针杂交便完全配对如有突变那么探针与靶序列不完全配对会降低杂交体得稳定性从而降低其熔解温度〔Tm〕。这样便可对突变和多态性进展分析。2.医学研究领域①病原体检测：由于实时荧光定量PCR方法可靠性和重复性好并且操作简便、快速、结果判断客观目前人们用此方法对人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、结核杆菌、巨细胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原体的检测。荧光定量PCR问世后的几年中积累了大量有关病原体核酸量与感染性疾病发生、开展和预后之间关系的资料这些研究资料不断丰富将形成感染性疾病的临床分子诊断标准。②药物疗效考核：利用实时荧光定量PCR技术检测临床样品中与抗药性相关的基因的表达。结果证明实时荧光定量PCR系统是定量检测抗药基因表达的可靠方法应用这种技术可以