荧光定量PCR的原理及使用.doc

荧光定量PCR的原理及使用荧光定量PCR(FQ-PCR)是新近出现的一种定量PCR检测方法。其基本特点是：1、用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。2、荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。3、动态实时连续荧光检测，免除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，高效、快速。下面介绍常用的几种检测方法：双链DNA内插染料某些染料如SYBRGreenⅠ能选择性地与双链DNA结合，同时产生强烈荧光。在PCR过程中SYBRGreenⅠ可与新合成的双链DNA结合，产生的荧光信号与双链DNA成正比。SYBRGreenI荧光染料技术原理SYBRGreenI是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBRGreen荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBRGreen染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBRGreen染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBRGreen染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。SYBRGreenI荧光染料与DNA双链的结合SYBRGreenI荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下，本法是一种成本低廉的选择。TaqMan探针技术原理TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。5，TaqMan探针的荧光信号产生机制根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TaqMan探针和TaqManMGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-FluorescentQuencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB(MinorGrooveBinder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10°C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqManMGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。TaqManMGB探针探针设计一般应符合以下条件：1、探针长度应在20~40个碱基左右，以保证结合的特异性。2、G、C碱基含量在40％-60％，避免单核苷酸序列的重复。3、避免与引物发生杂交或重叠。4、探针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。分子信标技术分子信标技术（molecularbeacon）也是在同一探针的两末端分别标记荧光分子和淬灭分子，与TaqMan探针不同的是该探针5′和3′末端自身可形成一个8个碱基左右的发卡结构，此时荧光分子和淬灭分子邻近，因此不会产生荧光。当溶液中有特异模板时，该探针与模板杂交，从而破坏了探针的发卡结构即FRET消失，于是溶液便产生荧光，荧光的强度与溶液中模板的量成正比，因此可用于PCR定量分析。Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,因此只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。1、双链DNA内插染料常用的是SYBRGreenI荧光染料，其技术原理：SYBRGreenI是一种只与DNA双链结合的