【精选】固定化酶与固定化细胞技术.ppt

固定化酶与固定化细胞技术王海磊河南师范大学生命科学学院AEM室2.酶在应用中受到的限制因素：（1）人工合成酶：应用化学合成法合成具有像酶那样活性的催化剂。这是有机合成和聚合化学中的最新技术。但距实际应用还有很大距离。（2）酶的人工“改性”、“修饰”：酶和细胞固定化是其中的一类。其它如基因工程、化学修饰等方法。难得的报道：人工合成脂肪酶获得成功随着生物产业的发展人类对环境逐步认识酶的广泛用途越来越得到人类的重视尤其脂肪酶在日化洗涤剂领域、医药美容领域、能源领域生物柴油生产中显得无可替代的优势。一般脂肪酶生产主要来源于发酵微生物生产法获得产量受到限制成本较高很难满足工业需求。关于人工合成脂肪酶在中国乃至世界未曾有过相关报道。经过不懈努力我公司通过人工合成的手段获得成功实属国际首例。经检验它不仅具备生物酶的通性具有生物酶的全效功能而且其催化性能、环境要求、毒化耐性各项指标远远高于普通生物酶。生产成本不足普通酶的三分之一而且不受产量的局限可大规模投入生产。石家庄市华北联化科技有限公司第一节固定化酶（ImmobilizedEnzyme）二、制备固定化酶的原则三、固定化酶的制备方法（1）无机吸附载体：矿物质和其它无机载体。高岭土：胰凝乳蛋白酶皂土：过氧化氢酶、核糖核酸酶氧化铝：葡萄糖氧化酶二氧化硅（覆盖卵磷脂/脑磷脂）：酸性磷酸酯酶、磷酸葡萄糖变位酶。不锈钢：直径100-200粒子以氧化钛处理可吸附β-半乳糖苷酶（17mg/g载体）。910（2）有机吸附载体纤维素粉：糖苷水解酶火棉胶：木瓜蛋白酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（70mg酶蛋白/cm2）)火棉胶：硝化棉溶液；硝化纤维素：用一种天然胶或合成胶增塑的树脂与之相结合通过溶剂蒸发而干燥后制成的材料。对眼睛、呼吸道粘膜有刺激作用。经呼吸道和消化道进入人体影响中枢神经系统。人接触后有咽喉痛、头痛、嗜睡、精神迟钝、腹痛、呕吐、皮肤及眼结膜充血、疼痛。本品极易燃。遇明火、高热、氧化剂或胺能引起燃烧爆炸。长期贮存能自燃。2、影响因素3、吸附法优缺点4、方法举例①酶的发酵生产Aspergillusoryzae3042扩大曲——40-50小时发酵——6倍冷蒸馏水抽提2次——压滤——酶液（亮黄色）测活力。（25μM/小时/ml）②载体予处理：DEAE-sephadex25溶胀——0.05mol/LNaOH处理——洗涤。③固定化：酶液调节pH7.0-7.0——与载体混合（载体湿重：酶液=1g：60ml）——4-7℃冷库搅拌吸附过夜——吸去上清液——用蒸馏水和0.15Mol/L醋酸钠水溶液洗涤——水洗涤后4℃备用。（二）共价结合法在进行一种酶的固定时首先要考虑酶的氨基酸组成、活性中心的氨基酸、立体结构及专一化学修饰对酶活性和影响。实际上共价偶联中最普遍使用的基团是：氨基、羧基、和苯环。共价偶联反应应注意的问题：(1)共价结合的功能基团不影响酶的催化活性。(2)反应尽可能温和(3)最好能在水溶液中进行(4)较高的反应专一性：只对某一类功能基团有很高的专一性而对其它基团或才水溶液几乎无副反应。载体选择时的注意问题：(1)理化性质：应是亲水性质的疏水载体往往对酶有变性的作用。(2)有尽能大的表面积：较细颗粒、多孔载体。(3)机械强度和稳定性(4)具备在温和条件下与酶结合的功能团。按载体连接的基团类型分为：(1)苯氨基载体(2)羧基载体(3)酯族氨基载体(4)硅烷化无机载体1、重氮法pH8-9重氮法常用的载体有：带苯氨基的珠状聚丙烯酰胺带苯氨基的多孔玻璃间氨基苯甲氧基纤维素对氨基苯纤维素。例：ABSE-纤维素固定化胰蛋白酶（4）偶联酶：A.配制酶液:20mg胰蛋白酶溶于16ml0.05MCaCl2-0.03ml正丁胺(保护剂)混合液(预先以1MHCl调至pH9.5)；B.ABSE-纤维素处理：取5gABSE-纤维素加10ml蒸馏水冰水浴边搅拌边加1MHCl、5%NaNO2各2.5ml摇匀冰浴15min抽滤取出滤饼迅速用预冷的0.05MHCl和蒸馏水各洗涤三次。(重氮化)C.偶联：滤饼投入胰蛋白酶液中立即用2MTris液调pH至7.5-7.8搅拌1h抽滤。D.洗涤：固定化酶以50ml3%NaCl搅拌洗涤3次水洗涤2次后悬浮于0.05MCaCl2溶液中冰箱保存备用。2、叠氮法反应原理3、溴化氰法多糖在高pH（10-11.5）用CNBr活化在稍低pH条件下连接蛋白游离氨基。亚氨基碳酸盐对蛋白的氨基的亲核反应十