固定化酶与固定化细胞.ppt

第四章固定化酶与固定化细胞本章内容什么是固定化酶？直接利用微生物酶——(一)为什么要固定化?(1)固定化在一定程度上可以改善酶的稳定性(2)固定化使酶和细胞的使用率提高(3)可精简产物分离工序固定化的第五种方法变性法(1)吸附法蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。载体：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得同时对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。吸附法特点吸附法（制备的工艺）吸附法（制备的工艺）(2)共价结合法共价偶联法的优点：得到的固定化酶结合牢固、稳定性好、利于连续使用。共价偶联法的缺点：载体活化的操作复杂，反应条件激烈，需要严格控制条件才可以获得较高活力的固定化酶。同时共价结合会影响到酶的空间构象，从而对酶的催化活性产生影响。共价结合法exampleA．重氮法B叠氮法B叠氮法C．烷基化反应法D．硅烷化法D．硅烷化法D．硅烷化法D．硅烷化法D．硅烷化法E．溴化氰法E．溴化氰法1)载体的物化性质要求载体亲水(避免吸附)，并且有一定的机械强度和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团。2)偶联反应的反应条件必须在温和pH、中等离子强度和低温的缓冲溶液中。3)所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其它功能基团副反应尽可能少。4)要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少载体的空间位阻对酶活力的影响。(3)交联法交联法共价交联法的四种形式1）酶直接交联法在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。操作简单，但是缺乏选择性，活力回收往往不高。2）酶辅助蛋白交联：当可得到的酶量有限，可以使用第二个“载体”蛋白来增加蛋白质浓度，从而使酶与惰性蛋白共交联的方法。这种“载体”蛋白即辅助蛋白，可以是白蛋白、明胶、血红蛋白等。3）吸附交联法：此法先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联，用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。4）载体交联法：用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中的另一部分功能基团偶联酶蛋白。(4)包埋法微胶囊特点包埋法的优点在于它是一种反应条件温和、很少改变酶结构但是又较牢固的固定化方法。包埋法的缺点是只有小分子底物和产物可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分子的酶并不适合。这是由于高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改变，使活力降低。微囊化制备方法A乳化分散：取含有酶和亲水性单体的水溶液，在不溶于水的有机溶媒中充分乳化。微胶囊的制备（example)-原位聚合NaCS-PDMDAAC微胶囊制备的反应过程示意图固定化酶的保存方法(三)固定化酶特性空间障碍效应(立体屏蔽)固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制(因为载体的空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部位造成了空间屏障)，使酶分子的活性基团不易于底物或效应物接触，影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作用,所造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍效应。分配效应由于载体和底物的性质差异引起了微环境和宏观环境之间的性质不同。微环境是在固定化酶附近的局部环境，而将主体溶液称为宏观环境。由这种不同造成的底物、产物和各种效应物在两个环境之间的不同分配，被称为分配效应。扩散限制效应酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产生了扩散阻力：1）、外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过程中的一种扩散限制效应，它发生在反应之前，发生在固定化颗粒周围的液膜层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。2）内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后传递到酶活性部位时的一种扩散阻力，它与催化反应同时进行。载体小而弯曲的细孔是产生内扩散阻力的要原因。因此使用低分子量底物，小的粒径、载体孔尽可能大而直且互相连通，或仅仅将酶固定在载体表面都可以降低这种内扩散阻力。固定化酶的特性固定化酶最适pH变化固定化酶最适pH变化二细胞的固定化(一)细胞固定化所用的方法细胞固定化所用的方法2.4%左右的卡拉胶，70℃溶解,再冷却到42℃,+10%左右的细菌菌体(预热到42℃）迅速混合均匀4℃冰箱放置大约30min取出后切成3×3mm的小颗粒Exmaple聚丙烯酰胺包埋固定化细胞(二)固定化细胞的特性细胞特性比较(固定化中要注意事项）三辅酶的固定化辅酶的固定化辅酶的固定化（example）后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用资料仅供