酶及细胞的固定化.ppt

第二章酶与细胞的固定化1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）。
2.不能回收，也使产物中混杂酶蛋白。
3.分离纯化困难。
一、固定化酶和固定化细胞的定义及特点
1.固定化酶(immobilizedenzyme)
固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。
什么是固定化酶？优点：
(1)可提高稳定性。
(2)能回收，易与产物分离，可反复使用。
缺点：
(1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。
(2)酶活性下降。2.固定化细胞（immobilizedcell）
固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。优越性：
(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作;
(2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系
完成部分代谢过程。
局限性：
(1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副
产物。
(2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制
作用。3.固定化原生质体
意义：
(1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和胞内产物的分泌。
(2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，由于载体的保护作用，稳定性提高。二、固定化方法依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用，使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂上。
根据吸附剂的特点分:
1）物理吸附法（physicaladsortion）
作用力：氢键、疏水键
常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、
硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。
2）离子结合法（ionbinding）
作用力：离子键
常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-
纤维素优点：条件温和，操作简便，酶活力损失少。
缺点：结合力弱，易解吸附。
借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。2）偶联方法：
偶联成功与否取决于：
载体：功能基团：芳香氨基，羧基，羧甲基等。
酶分子:侧链非必需基团：羧基，巯基，羟基，酚基，咪唑基。
常用的偶联反应有：重氮化法、叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。
优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。
缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。
3.交联法（crosslinking）
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的固定化方法。
双功能试剂：
常用的是戊二醛
O O
H—C—CH2—CH2—CH2—C—H
戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨基反应,使酶蛋白交联。
交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。
酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保持溶解状态。
酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为不溶态。缺点：
(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。
(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。
4.包埋法（entrapment）1）网格型包埋法
（gel(lattic)entrapment）
又称凝胶包埋法海藻酸钙凝胶包埋法：
滴至
海藻酸钠溶液＋E(orcell)CaCl2溶液中IE(orIC)

角叉菜胶包埋法：
滴至
角叉菜胶＋E(orcell)KCl溶液中IE(orIC)

聚丙烯酰胺凝胶包埋法：
AP
Acr+Bis+E(orcell)IE(orIC)
TEMED2）微囊型包埋法
（microencapsulation）
又称半透膜包埋法
将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜内。半透膜：直径几十微米到几百微米，厚约25nm。
半透膜孔径<酶分子孔径，小于半透膜孔径的小分子底物和产物可以自由进出，被称为“人工细胞”。与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点：
1）固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。
2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。
缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。
包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比：
优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。
缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。吸附法共价偶联法交联法包埋法

酶的四种固定化方法固定化方法1)直接固定法
不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、化学方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接固定。
一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。
2)吸附法
3)包埋法例如：葡萄糖异构酶(白色链霉菌)，是一种胞内酶。在50--80℃加热10分钟，使菌体自溶作用的酶失活，而葡萄糖异构酶仍然保持活性，长期使用酶活力不减少。

实验：
2.4%左右的卡拉胶，70℃溶解,再冷却到42℃,+10%左右的细菌菌体(预热到42℃）

迅速混合均匀

4℃冰箱放置大约30min

取出后切成3×3mm的小颗粒（一）酶的活性：
通常低于天然酶（有例外）。
（二）酶的