一种泰乐菌素产生菌、遗传改造方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103849591103849591A(43)申请公布日2014.06.11(21)申请号201210517193.9(22)申请日2012.12.05(83)生物保藏信息CGMCCNo.67172012.10.29(71)申请人中国科学院上海有机化学研究所地址200032上海市徐汇区零陵路345号申请人山东鲁抗舍里乐药业有限公司(72)发明人刘文赵群飞张华董坤彭欣李慧芬(74)专利代理机构上海一平知识产权代理有限公司31266代理人祝莲君雷芳(51)Int.Cl.C12N1/21(2006.01)C12P19/62(2006.01)C12N15/76(2006.01)C12R1/54(2006.01)权利要求书2页权利要求书2页说明书10页说明书10页序列表4页序列表4页附图3页附图3页(54)发明名称一种泰乐菌素产生菌、遗传改造方法及其应用(57)摘要本发明涉及一种泰乐菌素产生菌、遗传改造方法及其应用。通过对泰乐菌素生物合成基因簇中碳霉糖合成基因簇(包含tylCVII、tylCV、tylCIII、tylCIV及tylCII)的同框敲除，获得可以直接生产替米考星的合成前体—泰乐菌素B(Tb)的菌株。本发明的泰乐菌素产生菌可直接发酵生产替米考星的合成前体，简化替米考星的合成工艺。CN103849591ACN1038495ACN103849591A权利要求书1/2页1.一种泰乐菌素产生菌，其特征在于，所述的产生菌的发酵产物中，泰乐菌素B(Tb)的相对含量满足下式：B/(A+B)≥95%式中，B为发酵产物中泰乐菌素B(Tb)的质量；A为发酵产物中泰乐菌素A(Ta)的质量。2.如权利要求1所述的泰乐菌素产生菌，其特征在于，所述泰乐菌素产生菌为弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae)SWL00020，保藏编号为：CGMCCNo.6717。3.如权利要求1所述的泰乐菌素产生菌，其特征在于，所述产生菌的基因组中碳霉糖合成基因簇被失活或敲除；优选地，所述产生菌中缺失以下5种基因：tylCVII、tylCV、tylCIII、tylCIV和tylCII；或优选地，所述产生菌不表达以下5种基因：tylCVII、tylCV、tylCIII、tylCIV及tylCII。4.一种权利要求1所述的泰乐菌素产生菌的用途，其特征在于，它被用做发酵生产泰乐菌素B(Tb)的工程菌株。5.一种生产泰乐菌素B(Tb)的方法，其特征在于，包括步骤：(a)培养权利要求1所述的泰乐菌素产生菌，从而产生含有泰乐菌素B的发酵产物；和(b)从发酵产物中分离出泰乐菌素B(Tb)。6.一种生产替米考星的方法，其特征在于，(a)培养权利要求1所述的泰乐菌素产生菌，从而产生含有泰乐菌素B(Tb)的发酵产物；(b)从发酵产物中分离出泰乐菌素B(Tb)；和(c)将分离出的泰乐菌素B(Tb)转化为替米考星。7.一种制备泰乐菌素产生菌的方法，其特征在于，包括步骤：(1)构建用于同源重组的载体，所述的载体依次含有以下元件：碳霉糖合成基因簇上游同源臂序列，连接序列，和碳霉糖合成基因簇下游的同源臂序列；(2)将步骤(1)的所述载体导入出发菌株，获得导入载体的菌株，其中所述的出发菌株可发酵产生泰乐菌素A(Ta)和泰乐菌素B(Tb)；(3)从步骤(2)获得的导入载体的菌株中，筛选所述上游同源臂序列和下游同源臂序列与出发菌株的基因组发生了二次同源重组的菌株，从而获得泰乐菌素产生菌。8.一种用于同源重组的载体，其特征在于，所述载体依次含有以下元件：碳霉糖合成基因簇上游同源臂序列，连接序列，和碳霉糖合成基因簇下游的同源臂序列，且所述载体缺失碳霉糖合成基因簇。9.如权利要求8所述的载体，其特征在于，所述碳霉糖合成基因簇包含基因tylCVII、tylCV、tylCIII、tylCIV及tylCI；优选地，所述碳霉糖合成基因簇的序列如SEQIDNO：1所示。10.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求8所述的载体或染色体整合有碳霉糖合成基因簇上游和下游同源臂序列和3’同源臂序列，且缺失90%以上的碳霉糖合成2CN103849591A权利要求书2/2页基因簇。3CN103849591A说明书1/10页一种泰乐菌素产生菌、遗传改造方法及其应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种泰乐菌素产生菌、遗传改造方法及其应用，本发明还涉及一种直接发酵生产替米考星合成前体泰乐菌素B的方法。背景技术[0002]禽类呼吸道感染诱发的疾病是当今危害畜牧业发展的主要原因之一，目前用于防治此类疾病的有效药物很少，主要是采用大环内酯类药物泰乐菌素。泰乐菌素(Tylosin)，又名泰乐星、泰洛霉素，