靶向基因DNA分子探针的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号(10)授权公告号CN102952794B(45)授权公告日(45)授权公告日2015.02.25(21)申请号201210324630.5CN101514372A,2009.08.26,全文.CN101831496A,2010.09.15,全文.(22)申请日2012.09.05(73)专利权人张家港蓝苏生物工程有限公司审查员张彬地址215600江苏省苏州市张家港市经济开发区国泰北路1号E栋309号(72)发明人方园(74)专利代理机构苏州创元专利商标事务所有限公司32103代理人孙仿卫赵艳(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)(56)对比文件权利要求书5页说明书12页CN1926247A,2007.03.07,全文.序列表13页附图3页(54)发明名称靶向基因DNA分子探针的制备方法(57)摘要本发明公开了靶向基因DNA分子探针的制备方法，其将网路生物医学信息学和实验室分子生物学有机的结合起来，通过使用网路的或计算机的生物医学信息学工具，来确定人类基因组中疾病基因序列或正常基因序列，剔除其中的非特异的重复DNA片断，保留独特的和特异的疾病基因序列或者基因组特有的正常基因序列。整个DNA探针制作过程包括两大程序：第一程序是将基因的DNA序列确定并排除非特异性重复片段，第二程序是在第一程序的设计和指导下，应用实验室分子生物学的手段将此DNA探针实际地制造出来。本发明制造的探针可用于在福尔马林固定、石蜡包埋的组织和细胞切片以及细胞涂片的临床病理标本上进行以形态学为基础的原位杂交反应包括荧光原位杂交和非荧光的显色原位杂交，用于各级各类疾病基因的检测和诊断，还可用于正常人类基因和非人类基因的测定。CN102952794BCN102952794B权利要求书1/5页1.一种靶向基因DNA分子探针的制备方法，其特征在于：包括第一程序，其利用基于计算机的生物信息学手段来获得靶向基因的特异性DNA序列，并设计出相应PCR引物；第二程序，其根据第一程序的设计应用分子生物学手段来制造DNA分子探针；所述第一程序包括以下步骤：(1)在公共基因库上搜索到靶向基因的基因组位置，然后识别出该靶向基因的编码序列和非编码序列，剔除掉其中的非特异性重复序列，获得覆盖整个靶向基因的特异性DNA序列，该特异性DNA序列为不连续的多个DNA片段；(2)给靶向基因的特异性DNA序列中每一个DNA片段设计出成对PCR引物，引物长度为18-25个碱基；所述第二程序包括以下步骤：(1)以正常组织的基因组DNA为模板，利用第一程序的步骤(2)中设计出的PCR引物，用PCR方法扩增出第一程序的步骤(1)中确定的靶向基因的特异性DNA序列，扩增出的特异性DNA序列含有靶向基因的所有特异信息；(2)利用扩增出的特异性DNA序列制造特异性的DNA分子探针，该DNA分子探针能够与整个靶向基因的所有特异性DNA序列进行DNA-DNA杂交；在第二程序的步骤(2)中，将步骤(1)中扩增出的特异性DNA序列中每一个DNA片段均克隆到一个质粒载体上，克隆的质粒用作永久、稳定地特异性DNA序列来源，用PCR方法多次连续扩增所有质粒中克隆的DNA片段，其中每次扩增后的产物均进行稀释后再进行下次扩增，连续三次，最后一次扩增的产物即为未标记的DNA分子探针。2.根据权利要求1所述的靶向基因DNA分子探针的制备方法，其特征在于：设计所述靶向基因为人类肿瘤抑制基因-PTEN基因，通过所述第一程序的步骤(1)获得的特异性DNA序列为126个长度在150bp-4666bp的特异性DNA片段。3.根据权利要求2所述的靶向基因DNA分子探针的制备方法，其特征在于：所述PTEN基因的特异性DNA序列中一个DNA片段的序列为CATGAGGTGGTATTCATTTATTCATATAGTTAGAACAAAAAATATTTAAAATATTGAGGTAGAAACAAATTAGTCTCTTTTTAATTAAAAGCCAGATTACTTGTTAGAGTAACATTTTCCCAAATGAGGTAAAATTGTTGCGACTGTTAAACTTAAGGAAATTTTGATCTAGGTGTGGTATATACCTTCTTGTGGGGTGCTAATGAAAACAGGGATGGCAAAAATATTTTGTTTGTGAGTGTATGCATTTATGCTTTTTGACAACCTAAGAAACACTCTTACATCTGAGTATCTTTCATGGACTAGCTGTAGGAAATCTATATAAAATAGCTTAGTATACTGAAAGTATGACATAGTTTTACATATCTAGATTGTGGTTGTGATTATATATAATACTATAAAATATGCTAA