一种定量PCR法检测CHO细胞DNA残留量的方法及其标准品的建立.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN103421885A*(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103421885103421885A(43)申请公布日2013.12.04(21)申请号201210161343.7(22)申请日2012.05.23(71)申请人中国食品药品检定研究院地址100050北京市东城区天坛西里2号(72)发明人王军志饶春明王兰高凯李永红(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12N15/12(2006.01)权权利要求书1页利要求书1页说明书5页说明书5页附图6页附图6页(54)发明名称一种定量PCR法检测CHO细胞DNA残留量的方法及其标准品的建立(57)摘要本发明“一种实时定量PCR法检测CHO细胞宿主DNA残留量的方法及其标准品的建立”，建立了一种快速、准确、灵敏的CHO细胞DNA残留量的定量PCR测定方法及其标准品，属于生物制品质量控制中残留杂质检测领域。定量PCR法是残余DNA测定的未来发展趋势，该方法在特异性、灵敏性、准确性方面具有其独特的优势。本方法针对CHO细胞基因组中具有种属特异性且高度保守的ALU序列设计引物和探针，DNA含量在10fg～1ng范围内钱性良好；同时基于磁珠法建立了干扰样品前处理方法及CHO细胞DNA含量测定用标准品，本发明对于残余DNA风险的评估更加客观，在生物制品残余杂质质量控制方面具有重要意义。CN103421885ACN1034285ACN103421885A权利要求书1/1页1.定量检测CHO细胞DNA含量的标准品，是作为“代表国标”的阳性对照使用的CHO细胞全长基因组。2.根据权利要求1所述的标准品，其特征在于：定量检测为定量PCR检测。3.权力要求1和2所述的标准品在实时定量PCR法检测CHO细胞宿主DNA残留量中应用。4.一种实时定量PCR检测CHO细胞宿主DNA残留量的方法，是以待检测样品和权力要求1中所述的标准品为模板，利用根据CHO细胞特异性的保守序列-Alu序列设计的引物和Taqman探针进行定量PCR，对待测样品CHO细胞宿主DNA残留量进行定量。5.根据权力要求4所述的Taqman探针PCR方法，其特征在与针对Alu序列的引物和探针为：CHOAluForwardPrimer：5’-CAATTCCCAGCAACCACATG-3’CHOAluReversePrimer：5’-GAAGAGGGCACCAGATCTCATT-3’CHO-AluProbe：5’荧光基团-TGGCTCACAACAATC-荧光淬灭基团3’。6.根据权力要求4和5所述的定量PCR检测体系的设计方法，其特征在于：(1)检测体系退火温度的确定；(2)检测体系探针浓度和引物浓度的确定；(3)将国家标准品稀释到每μL含1000pg、100pg、10pg、1pg、0.1pg、0.01pg、0.001pg，得到标准曲线，检测该检测体系的灵敏性、定量限、线性范围。7.一种定量PCR法测定CHO细胞DNA残留量，其特征在于：通过PrepSEQResidualDNASamplePreparationKit建立了待测样品前处理方法，从而避免基质效应对于定量PCR测定的影响。2CN103421885A说明书1/5页一种定量PCR法检测CHO细胞DNA残留量的方法及其标准品的建立技术领域：[0001]本发明涉及一种快速、准确、灵敏的CHO细胞DNA残留量的定量测定方法及其标准的建立，属于生物制品质量控制中残留杂质检测领域。背景技术：[0002]生物制品的质量控制不仅仅是对终产品的质量控制，而是对整个生产过程的质量控制，包括原材料、中间产物、终产品以及生产过程的质控等等。细胞基质作为主要原材料，其质量的优劣，直接影响疫苗等生物制品的质量和产量，尤其是生物制品的安全性。一般认为，细胞基质存在的潜在危险因素包括：促生长蛋白及细胞残留蛋白、潜在病毒、细胞DNA。其中残余DNA一直是人们关注的热点。原代细胞和二倍体细胞在疫苗生产中已成功使用了40多年，证明是安全有效的，无致肿瘤性，因此国内外对于这两类细胞的DNA残留量没有限度要求。由于连续传代细胞(continuouscelllines，CCLs)调控生长的基因失调，使得传代细胞系具有无限的寿命。因此，理论上认为传代细胞系的DNA具有使其他细胞生长失控和产生致瘤活性的潜在能力，需要对其DNA残留量进行质量控制。[0003]由于残余DNA存在着潜在的危险性，许多机构对生物制品DNA残留量制定了相关标准。WHO和欧盟建议每人份传代细胞的纯化产品中可接受的残余DNA含量为10ng；美国FDA将生物制品可以允许的残余DNA限度修改为不超过100pg·剂量-1；对于大剂量的制品(如单克隆抗体)，DNA残留量放宽到10