新霉素半定量金标快速检测试剂盒及其检测方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103743908103743908A(43)申请公布日2014.04.23(21)申请号201310529332.4(22)申请日2013.10.31(71)申请人北京陆桥技术有限责任公司地址100123北京市朝阳区高碑店北路甲6号(72)发明人王丽哲唐慧林何艳玲赵瑜王丽丽于重楠刘敏李瑾(51)Int.Cl.G01N33/577(2006.01)权权利要求书2页利要求书2页说明书8页说明书8页附图2页附图2页(54)发明名称新霉素半定量金标快速检测试剂盒及其检测方法和应用(57)摘要本发明公开了一种新霉素半定量金标快速检测试剂盒及其检测方法和应用，属于免疫学领域，所述试剂盒包括样品稀释液，酶标板和新霉素金标快速检测条，所述检测条是由样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成；所述金标结合垫是胶体金标记的新霉素单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜中部包被有二条检测线和一条质控线，通过胶体金免疫层析技术将新霉素抗体和抗原的反应以有色反应显现出来，检测过程中可通过两种检测线颜色的变化判定乳制品中是否存在新霉素残留及其残留量范围。本发明的检测试剂盒能够实现残留物的半定量检测，检测方法简单、时间短，检测成本低，检测范围广，检测结果精确可靠，可广泛应用于食品中新霉素半定量检测。CN103743908ACN1037498ACN103743908A权利要求书1/2页1.一种新霉素金标快速检测试剂盒，所述试剂盒包括稀释液、酶标板和试纸条，所述试纸条包括样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于，所述金标抗体结合垫上包被有胶体金标记的新霉素单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜中部包被有两条检测线和一条质控线，两条检测线分别设置有能与金标新霉素单克隆抗体进行特异性结合的不同浓度的新霉素蛋白偶联抗原，质控线设置有羊抗鼠IgG单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的一种新霉素金标快速检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液为含有表面活性剂的磷酸缓冲溶液。3.根据权利要求1所述的一种新霉素金标快速检测试剂盒，其特征在于，所述金标抗体结合垫上的胶体金标记的新霉素单克隆抗体由新霉素单克隆抗体与25nm的胶体金颗粒以物理的方法结合组成。4.根据权利要求1所述的一种新霉素金标快速检测试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上检测线包被的新霉素蛋白偶联抗原，靠近胶体金结合垫端的包被浓度为0.05mg/ml，靠近吸水垫端的包被浓度为0.1mg/ml，包被量均为1μL/cm。5.根据权利要求1所述的一种新霉素金标快速检测试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上质控线包被羊抗鼠单克隆抗体，浓度为1mg/mL，包被量为1μL/cm。6.根据权利要求1所述的一种新霉素金标快速检测试剂盒，其特征在于，所述样品垫和金标抗体结合垫上包被有MAX线。7.根据权利要求1所述的一种多残留金标快速检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：（1）金标抗体结合垫的制备①.空白胶体金的制备：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒为25nm的胶体金溶液，具体方法为：在带有磁力搅拌子的三角烧瓶中加入97.5ml双蒸水和1ml1%氯金酸溶液加热至沸腾并持续沸腾3～5min后，加入1.5mL1%的柠檬酸三钠溶液，继续煮沸至液体呈现桔红色，保持沸腾状态10min后停止加热，将烧瓶中的搅拌子取出，溶液置室温充分冷却后，冷藏备用；②.胶体金标记抗体的制备：取空白胶体金溶液100ml，加入浓度为0.1g/L的碳酸钾溶液400～450μL，匀速缓慢搅拌7～10min后，在搅拌状态下逐滴加入稀释好的待标记抗体，1mL胶体金颗粒标记新霉素单克隆抗体的量为3ng，继续搅拌30min后，离心，吸除上清，沉淀用金标抗体重悬液充分重悬；③.金标抗体结合垫的制备：将重悬好的金标抗体用金标抗体重悬液进行对倍稀释后，按每条2ml的量包被于尺寸为30*1cm玻璃纤维素膜上，37℃干燥过夜，干燥后成金标抗体结合垫，于密封避光干燥处保存，使用时取出。（2）硝酸纤维素膜上T、C线的包被①.新霉素-蛋白偶联物的制备取16mgNEO（新霉素）溶于1mLPBS中，20mgBSA（牛血清白蛋白）溶于1mLPBS中，将NEO溶液加入BSA溶液中放在磁力搅拌器上搅拌,取EDC（水溶性碳化二亚胺）30mg溶于1.5mLPBS中，将EDC液逐滴加入上述反应液中，搅拌反应2h，再将10mgEDC溶于0.5mL2CN103743908A权利要求书2/2页PBS中，逐滴加入，室温搅拌反应24h.。将反应产物装入透析袋透析3d，每8h换液一次，透析后分装于-20℃贮存。②.T、C线的包被调试好三维喷点平台，将2种高低不同浓度的新霉素蛋白偶联物通过划线的方式按顺序包被在硝酸纤维素膜上