一种化学衍生化方法及其在LC-MS法检测核酸修饰中的应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN104502492A(43)申请公布日2015.04.08(21)申请号201510018723.9(22)申请日2015.01.14(71)申请人武汉大学地址430072湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学(72)发明人袁必锋冯钰锜唐阳(74)专利代理机构武汉科皓知识产权代理事务所(特殊普通合伙)42222代理人张火春(51)Int.Cl.G01N30/06(2006.01)G01N30/02(2006.01)C12Q1/68(2006.01)权利要求书1页说明书7页附图3页(54)发明名称一种化学衍生化方法及其在LC-MS法检测核酸修饰中的应用(57)摘要本发明公开了一种化学衍生化方法及其在LC-MS法检测核酸修饰中的应用。本发明使用2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮（BDAPE）对DNA中5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶的衍生化策略。在显著改善了这些修饰核苷在反相液相色谱中的保留行为的同时，也极大地提高了它们在质谱中的检测灵敏度。该方法灵敏度高、选择性高、操作简便，且无需进行繁琐的样品前处理，就可以定量检测DNA中极低丰度的胞嘧啶修饰，可以应用在分析疾病与5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶相互关系的研究中。CN104502492ACN104502492A权利要求书1/1页1.一种化学衍生化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）首先用S1核酸酶、蛇毒磷酸二酯酶和碱性磷酸酶对核酸进行消解，得到消解液，除去酶；（2）将石墨化碳黑填入固相萃取小柱，用去离子水活化后，将除酶后的消解液上样至固相萃取小柱中；然后用去离子水进行清洗脱去盐分，再用二氯甲烷、甲醇、浓氨水体积比为6~8：2~4：0.2~0.5的解吸液进行解析；然后在37oC下用氮气将解析液吹干，得到固体残留物；（3）将固体残留物溶于乙腈中，然后依次加入碱性催化剂和2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮，混合均匀，形成反应体系；反应体系在50~70oC下避光震荡反应4~16小时即成；所述的反应体系中，胞嘧啶核苷、碱性催化剂、2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮的摩尔比为1：2000~16000：2500~100000，碱性催化剂的浓度为1~8mM，2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮的浓度为1.25~50mM。2.根据权利要求1所述的化学衍生化方法，其特征在于：所述步骤（1）中除去酶的方式为：将消解液装入微型超滤膜中，在12000r/min的速率下离心即除去S1核酸酶、蛇毒磷酸二酯酶和碱性磷酸酶。3.根据权利要求1所述的化学衍生化方法，其特征在于：所述的解吸液中二氯甲烷、甲醇、浓氨水的体积比为6：4：0.5。4.根据权利要求1所述的化学衍生化方法，其特征在于：所述的碱性催化剂为叔铵类化合物、吡啶、氨水或三乙胺。5.根据权利要求1所述的化学衍生化方法，其特征在于：所述步骤（3）中的振荡速率为1500r/min。6.根据权利要求1所述的化学衍生化方法，其特征在于：所述步骤（3）中的反应温度为60oC，反应时间为6小时。7.根据权利要求1所述的化学衍生化方法，其特征在于：所述的反应体系中，胞嘧啶核苷、碱性催化剂、2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮的摩尔比为1：8000：8000，三乙胺的浓度为4mM，2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮的浓度为4mM。8.根据权利要求1所述的化学衍生化方法，其特征在于：样品衍生化完成后，反应液在37oC下用氮气吹干，所得固体复溶于水中直接进行反相液相色谱-电喷雾质谱分析。9.权利要求1~8任一项所述的化学衍生化方法在核酸修饰分析领域中的应用。2CN104502492A说明书1/7页一种化学衍生化方法及其在LC-MS法检测核酸修饰中的应用技术领域[0001]本发明涉及一种化学衍生化结合LC-MS的方法及其在DNA和RNA修饰分析中的应用。背景技术[0002]在哺乳动物的DNA中，胞嘧啶5位会在DNA甲基转移酶的作用下发生甲基化修饰，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。5-mC参与许多重要生物学过程，如基因组印迹、基因表达调控等是一种重要的表观遗传学修饰。5-甲基胞嘧啶可以被TET蛋白进一步地连续氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)、5-醛基胞嘧啶(5-foC)和5-羧基胞嘧啶(5-caC)，形成新的修饰。这些新发现的修饰成分与多种重要生理功能密切相关，例如细胞分化、细胞重编程、神经系统发育、疾病的发生与发展等等。正常人的DNA修饰水平是稳定的，异常的DNA修饰水平只会导致一系列疾病的发生，比如癌症、老年痴呆症、糖尿病等疾病。[0003]研究这些DNA修饰的生物学功能需要对其进行准确的定量分析，然