一种核酸羟甲基化修饰的检测方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112029834A(43)申请公布日2020.12.04(21)申请号202011031587.4(22)申请日2020.09.27(71)申请人中国科学院上海微系统与信息技术研究所地址200050上海市长宁区长宁路865号(72)发明人陈世兴宋世平赵之涵李铁王跃林(74)专利代理机构广州三环专利商标代理有限公司44202代理人郝传鑫贾允(51)Int.Cl.C12Q1/6858(2018.01)C12Q1/6827(2018.01)权利要求书1页说明书6页附图3页(54)发明名称一种核酸羟甲基化修饰的检测方法及其应用(57)摘要本发明公开了一种核酸羟甲基化修饰的检测方法及其应用，所述方法包括以下步骤：将核酸样品分为两份，分别为第一样品和第二样品；所述第一样品依次经过氧化反应、亚硫酸盐处理和PCR扩增，得到氧化硫化扩增物；所述第二样品依次经过亚硫酸盐处理和PCR扩增，得到硫化扩增物；将所述氧化硫化扩增物与所述硫化扩增物杂交产生错配，形成杂交结构；酶切割所述杂交结构，得到目标样品；采用生化传感器对所述目标样品进行定量检测。本发明利用错配切割酶识别由于氧化反应在羟甲基胞嘧啶位点产生的错配，借助电化学平台产生差别信号，能够检测基因中任意位点的羟甲基胞嘧啶变化情况，从而可以成为细胞分化、肿瘤发生及药物疗效等评估的关键技术和手段。CN112029834ACN112029834A权利要求书1/1页1.一种核酸羟甲基化修饰的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将核酸样品分为两份，分别为第一样品和第二样品；所述第一样品依次经过氧化反应、亚硫酸盐处理和PCR扩增，得到氧化硫化扩增物；所述第二样品依次经过亚硫酸盐处理和PCR扩增，得到硫化扩增物；将所述氧化硫化扩增物与所述硫化扩增物杂交产生错配，形成杂交结构；酶切割所述杂交结构，得到目标样品；采用生化传感器对所述目标样品进行定量检测。2.根据权利要求1所述的核酸羟甲基化修饰的检测方法，其特征在于，所述核酸样品来自基因组DNA。3.根据权利要求1所述的核酸羟甲基化修饰的检测方法，其特征在于，在所述氧化反应中，采用高钌酸钾，将羟甲基胞嘧啶氧化为醛甲基胞嘧啶。4.根据权利要求1所述的核酸羟甲基化修饰的检测方法，其特征在于，所述将所述氧化硫化扩增物与所述硫化扩增物杂交产生错配，形成杂交结构，具体包括：在杂交缓冲液中，将所述氧化硫化扩增物与所述硫化扩增物等量混合，高温变性后进行杂交，在氧化反应前的羟甲基胞嘧啶的位点产生错配。5.根据权利要求4所述的核酸羟甲基化修饰的检测方法，其特征在于，所述杂交缓冲液中镁离子的浓度不大于1mM。6.根据权利要求1所述的核酸羟甲基化修饰的检测方法，其特征在于，在酶切割所述杂交结构，得到目标样品的步骤中，采用的切割酶为T7内切酶、TDG酶、内切酶Ⅴ和TaqMuts酶中的任意一种。7.根据权利要求1所述的核酸羟甲基化修饰的检测方法，其特征在于，在酶切割所述杂交结构，得到目标样品的步骤中，酶切时间不大于16小时。8.根据权利要求1所述的核酸羟甲基化修饰的检测方法，其特征在于，在采用生化传感器对所述目标样品进行定量检测的步骤中，所述定量检测采用电化学平台、荧光类光学平台和场效应晶体管类电学平台中的任意一种。9.根据权利要求1所述的核酸羟甲基化修饰的检测方法，其特征在于，所述采用生化传感器对所述目标样品进行定量检测，具体包括：制备对照样品，所述对照样品为所述杂交结构经去离子水处理得到；采用生化传感器对所述目标样品和所述对照样品进行检测，所述目标样品与对照样品产生信号差，所述信号差为羟甲基胞嘧啶的浓度信号。10.一种如权利要求1-9任一项所述的核酸羟甲基化修饰的检测方法的应用。2CN112029834A说明书1/6页一种核酸羟甲基化修饰的检测方法及其应用技术领域[0001]本发明涉及修饰核酸的检测和分析技术领域，尤其涉及一种核酸羟甲基化修饰的检测方法及其应用。背景技术[0002]表观遗传是由非DNA序列改变引起的遗传，其导致基因表达和基因编码功能的改变，而且可以将遗传信息伴随DNA表观修饰传递到子代。随着研究的深入，研究者对表观遗传的认识越来越清楚，表观修饰在基因表达、个体发育、癌症发生、发展等方面起到了重要作用。其中，研究的最清楚是甲基化胞嘧啶，尤其是在癌症的检测和治疗方面，甲基化胞嘧啶已经成为了肿瘤诊断的新标志物，同时其在药效评估、术后监控等方面的作用也越来越受到关注。而其去甲基化的中间产物羟甲基胞嘧啶，在去甲基化通路被解析之后，羟甲基胞嘧啶成为了表观遗传领域的一颗新星，是神经、记忆等领域新的研究热点。[0003]然而，利用传统的研究方法，并不能将甲基化胞嘧啶和羟甲基胞嘧啶区分开。虽然现在已经发展出来较多