一种脱细胞角膜组织及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN104511053A(43)申请公布日2015.04.15(21)申请号201510099226.6(22)申请日2015.03.06(71)申请人青岛中皓生物工程有限公司地址266101山东省青岛市崂山区株洲路168号(72)发明人王宝泉李青(74)专利代理机构北京润平知识产权代理有限公司11283代理人金迪李婉婉(51)Int.Cl.A61L27/38(2006.01)权利要求书1页说明书11页附图2页(54)发明名称一种脱细胞角膜组织及其制备方法和应用(57)摘要本发明涉及角膜基质替代物领域，公开了一种脱细胞角膜组织及其制备方法，该方法包括：将在无菌条件下切取的新鲜动物眼球的角膜基质片依次进行低渗溶胀、反复冻融、酶消化、超声、灭菌和湿态封存处理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的缓冲液进行处理。本发明还提供了所述脱细胞角膜组织在作为角膜基质替代物中的应用。本发明的方法最大程度地减少了对角膜基质胶原结构的破坏，胶原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，无细胞残留，板层结构保留完整，提高了支架材料的生物相容性，并且在角膜基质不变性的前提下使得脱细胞角膜组织能够长期湿态保存。CN104511053ACN104511053A权利要求书1/1页1.一种脱细胞角膜组织的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将在无菌条件下切取的新鲜动物眼球的角膜基质片依次进行低渗溶胀、反复冻融、酶消化、超声、灭菌和湿态封存处理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的缓冲液进行处理。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酶消化处理的条件包括：DNA酶与缓冲液的体积比为1:500-1500，RNA酶与缓冲液的体积比为1:1500-2500，温度为30-40℃，时间为2-4h。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述超声处理的条件包括：温度为20-40℃，超声功率为200-500W，超声时间为2-5h。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述湿态封存处理的方式包括将经过灭菌处理得到的产物置于保存液中封存，所述保存液为含有Ⅰ型胶原蛋白和硫酸软骨素的保存液；优选地，所述保存液的成分包括：1-5重量％的右旋糖酐，0.1-2重量％的Ⅰ型胶原蛋白，0.05-1重量％的硫酸软骨素，0.005-0.02重量％的抗氧化剂，0.005-0.02重量％的抗生素，其余成分为三蒸水；进一步优选地，保存液中Ⅰ型胶原蛋白的含量为0.5-1.5重量％，硫酸软骨素的含量为0.4-0.8重量％。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述右旋糖酐的分子量为20-40kDa；所述Ⅰ型胶原蛋白的来源为猪、牛、鱼或人；所述抗氧化剂包括维生素C和/或维生素E；所述抗生素包括妥布霉素、青霉素、链霉素和庆大霉素中的至少一种。6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述置于保存液中封存的温度为4-8℃。7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中，所述在无菌条件下切取新鲜动物眼球的角膜基质片的方法包括：先将新鲜动物眼球用酒精或含妥布霉素的PBS溶液浸泡，再在无菌条件下切取角膜基质片；所述酒精的体积百分浓度优选为70-80％，所述妥布霉素的浓度优选为30000-50000U/L，所述浸泡时间优选为10-30s；所述切取的角膜基质片的直径优选为8-10mm，厚度优选为200-600μm；所述动物优选为猪、牛或猴，进一步优选为猪。8.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中，所述低渗溶胀处理的方法包括：将切取的角膜基质片放在低渗液中浸泡至溶胀，所述低渗液为三蒸水，所述浸泡的时间为8-12h。9.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中，所述反复冻融的条件包括：冷冻时间为30-60min，冷冻温度为-200～-50℃，融化时间为15-30min，融化温度为30-40℃，循环次数为2-5次。10.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中，所述灭菌的条件包括：采用钴-60或电子束辐照灭菌，辐照剂量为20-30kGy。11.权利要求1-10中任意一项所述的方法制备得到的脱细胞角膜组织。12.权利要求11所述的脱细胞角膜组织在作为角膜基质替代物中的应用。2CN104511053A说明书1/11页一种脱细胞角膜组织及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明涉及角膜基质替代物领域，具体地，涉及一种脱细胞角膜组织及其制备方法和应用。背景技术[0002]角膜位于眼球最表面，直接与外界接触，容易受到损伤(物理、化学)和感染，一旦发生病变则会发生混浊而影响视力，甚至致盲。常见的角膜病变有角膜炎、角膜溃疡、圆锥角膜、角膜软化症和角膜变性等。据世界卫生组织(WHO)统计，目前全世界有角膜病盲患者近5000万人，我国有约400万人。角膜病严重影响了患者们的