一种体外获能后精子质量评估的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105695557A(43)申请公布日2016.06.22(21)申请号201610147269.1(22)申请日2016.03.16(71)申请人四川大学华西第二医院地址610000四川省成都市武侯区人民南路3段20号(72)发明人马芳马黔红潘倩(74)专利代理机构成都天嘉专利事务所(普通合伙)51211代理人邹翠(51)Int.Cl.C12Q1/34(2006.01)权利要求书1页说明书7页附图1页(54)发明名称一种体外获能后精子质量评估的方法(57)摘要本发明提供了一种体外获能后精子质量评估的方法。具体步骤如下：A、收集新鲜液化精液标本，用磷酸缓冲液或者BWW培养液洗涤精子，充分除去残留的精浆成分，再离心分离出精子；B、向A步骤分离出的精子中加入BWW培养液，采用上游法，收获上游精子，计数精子数量，用体外获能液在5%的CO2细胞培养箱中孵育精子3~4h；离心分离，收取的上清液再次离心分离，收取上清液作为待测样本；C、测定精子获能液中唾液酸酶的活性，最后得出唾液酸酶活性/精子数目的值即可。通过精子体外获能后获能液中唾液酸酶活性的检测，为临床原因不明的男性不育患者提供诊断依据及临床咨询。CN105695557ACN105695557A权利要求书1/1页1.一种体外获能后精子质量评估的方法，其特征在于：具体步骤如下：A、精子的洗涤收集新鲜液化精液标本，用磷酸缓冲液或者BWW培养液洗涤精子，充分除去残留的精浆成分，再离心分离出精子；B、精子的体外获能向A步骤分离出的精子中加入BWW培养液，采用上游法，在5%的CO2细胞培养箱中培养，收获上游精子，计数精子数量，用体外获能液在5%的CO2细胞培养箱中孵育精子3~4h；离心分离，收取的上清液再次离心分离，收取上清液作为待测样本；C、精子获能液中唾液酸酶活性的测定（1）用检测缓冲液将唾液酸酶标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312/0mU/ml的浓度梯度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向检测板内依次加入各唾液酸酶标准溶液和待测样本；（2）用检测缓冲液稀释荧光试剂，将其加入上述各唾液酸酶标准溶液和待测样本的孔内，再将检测板置于37℃，避光孵育1-2小时后，用酶标仪读取各孔荧光强度，根据唾液酸酶活性标准曲线计算出待测样本的唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/精子数目的值即可。2.根据权利要求1所述的一种体外获能后精子质量评估的方法，其特征在于：所述的检测板为96孔黑板。3.根据权利要求1所述的一种体外获能后精子质量评估的方法，其特征在于：用检测缓冲液稀释至荧光试剂的浓度为0.05mM。4.根据权利要求1所述的一种体外获能后精子质量评估的方法，其特征在于：酶标仪在激发波长和发射波长分别为365nm和450nm的波长下读取各孔荧光强度。5.根据权利要求1所述的一种体外获能后精子质量评估的方法，其特征在于：所述的检测缓冲液为含0.05mmol/l乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液。6.根据权利要求5所述的一种体外获能后精子质量评估的方法，其特征在于：所述乙酸钠的pH值为5-6。7.根据权利要求1所述的一种体外获能后精子质量评估的方法，其特征在于：所述的体外获能液为含HSA5mg/ml的HTF。8.根据权利要求1所述的一种体外获能后精子质量评估的方法，其特征在于：所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶，浓度为5U/ml。9.根据权利要求1所述的一种体外获能后精子质量评估的方法，其特征在于：所述的荧光试剂是2′-4-甲基伞形酮基-α-D-N-乙酰神经氨酸钠。2CN105695557A说明书1/7页一种体外获能后精子质量评估的方法技术领域[0001]本发明属于医疗检测技术领域，具体涉及一种体外获能后精子质量评估的方法。背景技术[0002]随着社会工业的不断发展，不育夫妇的总发病率明显升高。2004年欧洲生殖学会统计：育龄夫妇1年内不能怀孕者占25%，其中15%寻求治疗，男方因素引起不育占50%。男性不育的病因有性功能障碍(1.7%)，精索静脉曲张(12.3%)，生殖道感染(6.6%)，先天性发育异常(2.1%)后天获得性疾病(2.6%)，内分泌紊乱(0.6%)，免疫性因素(3.1%)，其他异常(3%)，但是高达60%~75%的患者找不到原因，称为特发性男性不育，他们只表现为少精、弱精或畸形精子症等精子质量异常。不明原因的男性不育可能由于多种因素造成，如长期应激环境因素引起内分泌紊乱、活性氧和基因缺陷等。[0003]多年来，传统的精液常规分析一直是用于判断男性生育力的最基本临床指标。临床上对绝大部分的男性不育患者的真正不育原因仍然不清楚。尤其是临床上大约有三分之一不育患者，男性的常规精液分析结