一种植酸酶突变体及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105969750A(43)申请公布日2016.09.28(21)申请号201610467505.8(22)申请日2016.06.24(71)申请人北京昕大洋科技发展有限公司地址100081北京市海淀区中关村南大街乙12号天作国际1号楼B座911(72)发明人赵丽芳郭宝林苏俊兵黄丽丽(51)Int.Cl.C12N9/16(2006.01)C12N15/55(2006.01)C12N15/81(2006.01)C12N1/19(2006.01)A23K20/189(2016.01)C12R1/84(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表8页附图1页(54)发明名称一种植酸酶突变体及其应用(57)摘要本发明公布了一种新型植酸酶突变体，属于生物技术领域。该突变体在耐温性及酶活等方面均表现出良好的特性，具有较好的应用前景。该突变体经甲醇诱导96h发酵液酶活可达28000U/mL，较原始植酸酶提高180％；植酸酶经75℃处理后存留酶活保留在90％以上；突变体耐受85℃制粒温度，存留酶活达到85％以上，适应颗粒饲料生产要求。CN105969750ACN105969750A权利要求书1/1页1.一种植酸酶突变体，其特征在于，所述突变体为APPAm1，其氨基酸序列如序列表SEQIDNo.3所示。2.权利要求1所述植酸酶突变体的编码基因。3.权利要求2所述的植酸酶突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因如序列表SEQIDNo.1所示。4.权利要求1所述植酸酶突变体或权利要求2所述的基因的用途，其特征在于，用于饲料制备领域。5.一种包含权利要求3所述的基因的表达载体或宿主细胞。6.如权利要求5所述的表达载体或宿主细胞，其特征在于，所述表达载体为pPIC9K，宿主细胞为毕赤酵母GS115。2CN105969750A说明书1/5页一种植酸酶突变体及其应用技术领域：[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植酸酶突变体及其在饲料技术领域的应用。背景技术：[0002]植酸酶，也称肌醇六磷酸水解酶，是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸或磷酸盐的一类酶的总称，属磷酸单酯水解酶，它实际上包括植酸酶和酸性磷酸酶两种酶。植酸酶主要应用于猪、鸡、鸭等单胃动物以及一些鱼类水产动物的饲料添加剂，使植酸或植酸盐分子释放无机磷，从而被动物利用，以缓解或消除植食性饲料中植酸的抗营养作用，以提高生物机体对矿物质元素、蛋白质及微量元素的利用率，促进其生长发育，提高动植物的生产能力，能够减少磷向环境中排量达50％之多，进而降低由于磷的富集造成的环境污染问题。[0003]植酸酶在自然界中分布广泛，在植物、动物及微生物中都有发现，其中以来源于微生物，包括细菌、酵母菌及霉菌的植酸酶居多。产植酸酶的细菌以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌以及克雷伯菌为主。植酸酶的来源不同，它的最适温度和最适pH差异也较大，植物来源的植酸酶最适pH为4.0-7.5，因此不适合单胃畜牧类的酸性胃环境，而微生物来源的植酸酶最适pH有2个，即5.5和2.5，范围较宽，比较适合单胃动物，也因此微生物来源的植酸酶被广泛应用。通常微生物来源的植酸酶活性温度一般在45-57℃，超过65℃活性就降低超过一半。[0004]然而，植酸酶在生产上的主要用途就是作为饲料添加剂以提高磷的利用率。饲用酶在造粒的过程中需要经过一个75-93℃的短暂高温过程，而很多植酸酶在这个过程中将会降低酶活，甚至丧失酶活。于是，选择具有高热稳定性、且能够在动物胃肠道环境中保持高活性的植酸酶作为饲料添加剂就显得尤为重要。如何选择具有种这样要求的植酸酶就成为目前植酸酶应用研究的热点。[0005]随着基因工程和蛋白质工程的发展，人们把目光转向人为制造催化效率高、抗蛋白酶水解且热稳定性好的植酸酶。比如中国专利200810201709.2，公布了一种植酸酶突变体，该植酸酶突变体为单氨基酸位点突变体APPA-S22T，其最适pH值为4.5，比活性最高为1321U/mg蛋白质，在最适pH，突变体最高比活是野生型的3倍；中国专利201010602210.X，公开了一种在酸性范围的催化能力和比活性提高的植酸酶APPA-M及其基因和应用，突变位点为M216C和N306D，经过优化改良的植酸酶APPA-M其在酸性范围pH2到5的催化活性得到了很大的提高，可在应用中显示出巨大的应用潜力；中国发明专利201310125275.3，利用定点突变技术对基因的关键位点进行定点突变，获得突变基因Appa-M2,该突变体耐热性能好，85℃保温10分钟，残余酶活可达到60％，在饲料和食品工业中有广泛的应用前景。[0006]上述植酸酶的不同突变体在最适pH、温度、酶活及耐温性等方面均表现出不同的特性，本申请人在