一种D-氨基酸氧化酶突变体及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111019916A(43)申请公布日2020.04.17(21)申请号201811408085.1(22)申请日2018.11.23(71)申请人上海弈柯莱生物医药科技有限公司地址200240上海市闵行区东川路555号乙楼3114室(72)发明人田振华程占冰徐艳冰(74)专利代理机构上海弼兴律师事务所31283代理人薛琦王卫彬(51)Int.Cl.C12N9/06(2006.01)C12N15/53(2006.01)C12P9/00(2006.01)权利要求书2页说明书15页序列表106页(54)发明名称一种D-氨基酸氧化酶突变体及其应用(57)摘要本发明公开了一种D-氨基酸氧化酶突变体，其序列包括将SEQIDNO.1所示序列或与SEQIDNO.1至少有76％同一性的序列的第54位氨基酸残基N、第58位氨基酸残基F、第211位氨基酸残基C和第213位氨基酸残基M进行突变后的序列；所述D-氨基酸氧化酶突变体具有比野生型D-氨基酸氧化酶高的酶活性、酶活稳定性和/或耐铵性。本发明还公开了所述D-氨基酸氧化酶突变体在制备2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸中的应用。本发明的D-氨基酸氧化酶突变体酶活性很高、酶活稳定性提高和/或耐铵性增强，进而降低成本，利于工业化生产。CN111019916ACN111019916A权利要求书1/2页1.一种D-氨基酸氧化酶突变体，其特征在于，所述D-氨基酸氧化酶突变体的序列包括将SEQIDNO.1所示序列或与SEQIDNO.1至少有76％同一性的序列的第54位氨基酸残基N、第58位氨基酸残基F、第211位氨基酸残基C和第213位氨基酸残基M进行突变后的序列；所述D-氨基酸氧化酶突变体具有比野生型D-氨基酸氧化酶高的酶活性、酶活稳定性和/或耐铵性；较佳地，所述与SEQIDNO.1至少有76％同一性的序列如SEQIDNO.3所示。2.如权利要求1所述的D-氨基酸氧化酶突变体，其特征在于，所述D-氨基酸氧化酶突变体的序列包括将SEQIDNO.1所示的第54位氨基酸残基N突变为A、C、G、S、T或V；和/或，第58位氨基酸残基F突变为亲水性或小位阻的氨基酸残基；和/或，第211位氨基酸残基C突变为A、D、G、H、L、M、S或Y；和/或，第213位氨基酸残基M突变为A、C、F、L、R、S、T、V或W的序列。3.如权利要求2所述的D-氨基酸氧化酶突变体，其特征在于，所述第54位氨基酸残基N突变为V、第58位氨基酸残基F突变为Q、第211位氨基酸残基C突变为A、D、G、H、L、M、S或Y，和第213位氨基酸残基M突变为A、C、F、L、R、S、T、V或W；较佳地，所述第211位氨基酸残基C突变为A、G、M、S、Y或L，和/或，所述第213位氨基酸残基M突变为F、L、R、T或W；更佳地，所述第211位氨基酸残基C突变为L或M，和/或，所述第213位氨基酸残基M突变为T。4.如权利要求2所述的D-氨基酸氧化酶突变体，其特征在于，所述第211位氨基酸残基C突变为L，第213位氨基酸残基M突变为T，第54位氨基酸残基N突变为A、C、G、S、T或V，和第58位氨基酸残基F突变为A、G、H、K或Q；较佳地，所述第54位氨基酸残基N突变为A、G、S或T，和/或，所述第58位氨基酸残基F突变为H、K或Q；更佳地，所述第54位氨基酸残基N突变为A，和/或，所述第58位氨基酸残基F突变为H或K。5.如权利要求4所述的D-氨基酸氧化酶突变体，其特征在于，所述D-氨基酸氧化酶突变体的序列还包括将SEQIDNO.1所示的第56位氨基酸残基T突变为N、S或L；较佳地，所述第56位氨基酸残基T突变为N。6.如权利要求1～5任一项所述的D-氨基酸氧化酶突变体，其特征在于，所述D-氨基酸氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.5、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15、SEQIDNO.17、SEQIDNO.19、SEQIDNO.21、SEQIDNO.23、SEQIDNO.25、SEQIDNO.27、SEQIDNO.29、SEQIDNO.31、SEQIDNO.33、SEQIDNO.35、SEQIDNO.37SEQIDNO.39、SEQIDNO.41、SEQIDNO.43、SEQIDNO.45、SEQIDNO.47、SEQIDNO.49、SEQIDNO.51、SEQIDNO.53、SEQIDNO.55、SEQIDNO.57、SEQIDNO.59、SEQIDNO.61、SEQIDNO.63、SEQIDNO.65、SEQIDNO.68、SEQIDNO.70、SEQIDNO.72、SEQIDNO.75、SEQIDN