酶突变体及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115772508A(43)申请公布日2023.03.10(21)申请号202211180654.8C12N1/21(2006.01)(22)申请日2022.09.27C12P9/00(2006.01)C12P13/04(2006.01)(71)申请人浙江新安化工集团股份有限公司C12R1/19(2006.01)地址311600浙江省杭州市建德市江滨中路新安大厦1号(72)发明人楼亿圆何军光刘明华吴艳青陈显辉刘志伟胡贝贝姜胜宝任不凡周曙光秦龙徐亚卿(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227专利代理师张柳(51)Int.Cl.C12N9/06(2006.01)C12N15/53(2006.01)C12N15/70(2006.01)权利要求书2页说明书10页序列表（电子公布）附图1页(54)发明名称酶突变体及其应用(57)摘要本发明涉及生物催化技术领域，特别涉及酶突变体及其应用。本发明提供了来源于鲑色锁掷酵母的D‑氨基酸氧化酶的突变体，突变位点包括N54V、C56N、F58H、M216S、R116V和/或K319T。该突变体具有高酶活、高转化率的特点，可高效制备2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，产物收率高。CN115772508ACN115772508A权利要求书1/2页1.D‑氨基酸氧化酶的突变体，其特征在于，包括：所述D‑氨基酸氧化酶的第54位天冬酰胺被缬氨酸取代；和/或所述D‑氨基酸氧化酶的第56位半胱氨酸被天冬酰胺取代；和/或所述D‑氨基酸氧化酶的第58位苯丙氨酸被组氨酸取代；和/或所述D‑氨基酸氧化酶的第216位蛋氨酸被丝氨酸取代。2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，还包括：所述D‑氨基酸氧化酶的第116位精氨酸被缬氨酸取代；和/或所述D‑氨基酸氧化酶的第319位赖氨酸被苏氨酸取代。3.如权利要求1或2所述的突变体，其特征在于，包括：(a)、所述D‑氨基酸氧化酶来源于鲑色锁掷酵母；和/或(b)、所述D‑氨基酸氧化酶具有特定氨基酸序列；和/或(c)、所述D‑氨基酸氧化酶的基因具有特定核苷酸序列；所述特定氨基酸序列包括：(I)、如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；或(II)、如(I)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(I)的相同或相似；或(III)、与如(I)或(II)所示的氨基酸序列至少有70％同源性的氨基酸序列；所述多个为2个至110个；所述特定核苷酸序列包括：(IV)、如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；或(V)、如(IV)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(IV)的相同或相似；或(VI)、与如(IV)或(V)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；所述多个为2个至330个。4.如权利要求1至3任一项所述的突变体，其特征在于，具有：(1)、如SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8或SEQIDNO.10、任一所示的氨基酸序列；或(2)、如(1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或(3)、与如(1)或(2)所示的氨基酸序列至少有70％同源性的氨基酸序列；所述多个为2个至110个。5.编码如权利要求1至4任一项所述的突变体的核酸分子，其特征在于，具有：(4)、如SEQIDNO.3、SEQIDNO.5、SEQIDNO.7或SEQIDNO.9、任一所示的核苷酸序列；或(5)、如(5)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(5)的相同或相似；或(6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；所述多个为2个至330个。6.表达载体，其特征在于，包括如权利要求5所述的核酸分子，以及可接受的基因元件。2CN115772508A权利要求书2/2页7.宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求5所述的核酸分子或包括如权利要求6所述的表达载体。8.如权利要求1至4任一项所述的突变体、如权利要求5所述的核酸分子、如权利要求6所述的表达载体和/或如权利要求7所述的宿主细胞在如下方面中的应用：(i)、提高D‑草铵膦转化为2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的转化率；和/或(ii)、L‑草铵膦的合成。9.2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的合成方法，其特征在于，包括将草铵膦与如下任意项混合，反应，获得所述2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸：(A)、如权利要求1至4任一项所述的突变体；和/或(B)、如权利要求7所述的宿主细胞。10.如权利要求9所述的合成方法，其特征在于，所述反应的温度为20～37℃；和/或所述反应的时间