芽孢杆菌芽孢的纯化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106434519A(43)申请公布日2017.02.22(21)申请号201610856410.5(22)申请日2016.09.28(71)申请人中国科学院苏州生物医学工程技术研究所地址215163江苏省苏州市高新区科技城科灵路88号(72)发明人尹焕才田晶晶(74)专利代理机构北京远大卓悦知识产权代理事务所(普通合伙)11369代理人韩飞(51)Int.Cl.C12N3/00(2006.01)C12R1/07(2006.01)权利要求书1页说明书5页(54)发明名称芽孢杆菌芽孢的纯化方法(57)摘要本案涉及芽孢杆菌芽孢的纯化方法，包括：无菌水洗涤，浓缩；重盐洗液洗涤；酶溶液孵育；表面活性剂溶液洗涤；酶抑制剂溶液洗涤；无菌水再次洗涤；置于80℃水浴中灭菌；最终得到的芽孢杆菌芽孢以无菌水混悬，保存。本案在保证制备的芽孢数量的同时，极大提高了芽孢纯度；通过本案纯化方法可有效去除菌体营养细胞、培养基残留物质及破裂营养细胞释放的蛋白酶等活性物质，有效避免上述物质对芽胞的诱导转化；更利于芽孢悬液在水溶液中的长期保存；本工艺操作简单，工艺易于放大，衰减小，重复性好，易于工业化生产。CN106434519ACN106434519A权利要求书1/1页1.一种芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：1)无菌水洗涤：将芽孢杆菌芽孢粗品用无菌水在5000rpm、4℃下离心洗涤；并将芽孢杆菌芽孢的浓度调节至105-108/mL，得到芽孢菌体混合液；2)重盐洗涤：向所述芽孢菌体混合液中加入5-15倍重量的重盐洗液，混匀，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀一；3)酶溶液孵育：向所述沉淀一中加入酶消化液，悬浮沉淀，调节芽孢浓度至104-106/mL，37℃水浴加热1h后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀二；4)表面活性剂溶液洗涤：向所述沉淀二中加入表面活性剂溶液，使芽孢浓度达到104-106/mL，混匀后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀三；5)酶抑制剂溶液洗涤：向沉淀三中加入酶抑制剂溶液，混匀后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀四；6)无菌水洗涤：向所述沉淀四加入无菌水，震荡混匀后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀五；再次加入无菌水，混匀，置于80℃水浴中灭菌20min，离心；最终得到的芽孢杆菌芽孢以无菌水混悬，保存。2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其特征在于，所述高盐溶液包括有1M的KCl、0.5M的NaCl和无菌水。3.根据权利要求1所述的芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其特征在于，所述酶消化溶液包括有50μg/ml的溶菌酶和无菌水。4.根据权利要求1所述的芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其特征在于，所述表面活性剂溶液包括有0.05wt％的十二烷基硫酸钠和无菌水。5.根据权利要求1所述的芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其特征在于，所述酶抑制剂溶液包括有50mM的Tris-HCl缓冲液、10mM的EDTA、2mM的苯甲基磺酰氟和无菌水。6.根据权利要求2所述的芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其特征在于，所述高盐溶液还包括有0.1M的ZnCl2。7.根据权利要求6所述的芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其特征在于，所述高盐溶液还包括有0.1M的AlCl3。2CN106434519A说明书1/5页芽孢杆菌芽孢的纯化方法技术领域[0001]本发明涉及一种微生物芽孢制备领域，具体涉及一种芽孢杆菌芽孢的纯化方法。背景技术[0002]芽孢是在一定条件下，细菌的细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的休眠体，其具有极强的抗逆性，可耐受高温、低温、干燥、化学药物、营养缺乏等恶劣环境；依据其特点，芽孢杆菌的芽孢在各领域被广泛应用。[0003]由于芽孢杆菌的芽孢在颗粒料、粉料的加工过程中以及酸性环境中具有较高稳定性，储藏时间长，部分益生芽孢杆菌芽孢作为微生物添加剂，被用于饲料添加剂、口服益生菌制剂等，如枯草芽孢杆菌。同时，芽孢作为目前整个微生物界中抗逆性最强的生命体，在抗热，抗化学药物和抗辐射等方面，抵抗力极强，因此是否能消灭芽孢是衡量各种消毒灭菌手段的最重要的指标。[0004]生物指示剂以芽孢为指示菌株，用以监测消毒灭菌效果，是判断灭菌效果的金标准。比如，嗜热脂肪芽孢杆菌(ATCC7953)芽孢被用于监测压力蒸汽灭菌、过氧化氢低温等离子体灭菌等，枯草芽胞杆菌黑色变种(ATCC9372)芽胞被用于监测环氧乙烷灭菌、干热灭菌等。[0005]芽孢的纯度及芽孢抗力是准确评价各种因子对医疗器械消毒与灭菌效果的前提。依据中国药典及美国药典的要求，生物指示剂中的芽孢数量、芽孢与菌体营养细胞的比例必须达到一定程度，才能较好的反映灭菌效果。[0006]目前，芽孢生产