快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114806943A(43)申请公布日2022.07.29(21)申请号202210443916.9(22)申请日2022.04.26(71)申请人河南农业大学地址450002河南省郑州市金水区文化路95号(72)发明人李苗云梁栋王娜朱瑶迪赵丽君徐丽娜马阳阳赵改名孙灵霞柳艳霞(74)专利代理机构郑州优盾知识产权代理有限公司41125专利代理师张真真(51)Int.Cl.C12N1/20(2006.01)C12N3/00(2006.01)C12R1/125(2006.01)权利要求书2页说明书5页附图2页(54)发明名称快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法(57)摘要本发明公开了一种快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法，配备质量分数为65‑75%、80‑85%、90‑95%的蔗糖溶液，分别记为A、B、C溶液；将未纯化芽孢悬液离心后用4‑6mLA溶液将芽孢重悬，吸取15‑25mLC溶液加入到50mL无菌离心管中，防止溶液碰到管壁；吸取4‑6mLB溶液，逐滴、缓慢加入到C溶液上表面；将含有芽孢悬液的A溶液逐滴、缓慢加入到B溶液上表面，加入完后芽孢悬液在B液的上层；离心后分为上中下三层。本发明提供快速制备芽孢的方法用时短（≤24h），同时使用价格便宜的蔗糖对粗芽孢悬液进行快速分离纯化（≤2h），制备得到高纯度芽孢（≥98%）。CN114806943ACN114806943A权利要求书1/2页1.一种快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法；其特征在于，包括如下步骤：（一）芽孢的制备：a、将活化三代后的B.subtilis168菌株在LB平板上划线过夜培养至长出单菌落，挑选新鲜的单菌落转接到20mLLB液体培养基中200rpm、37℃过夜培养至OD600为1.2‑1.5；b、将步骤（2）中细菌悬液转接到促芽孢生长培养基DSM中培养20‑24h得到芽孢悬液；c、离心收集步骤b中芽孢悬液，得到未纯化芽孢悬液，用相差显微镜镜检芽孢形态，产芽孢率≥85%；（二）芽孢纯化：（1）配备质量分数为65‑75%、80‑85%、90‑95%的蔗糖溶液，分别记为A、B、C溶液；（2）取20‑30mL步骤c中未纯化芽孢悬液离心，用4‑6mLA溶液将芽孢重悬，使得芽孢悬液OD600≥20，置于冰上10‑30min；（3）用一次性吸管吸取15‑25mLC溶液加入到50mL无菌离心管中，防止溶液碰到管壁；（4）用一次性吸管吸取4‑6mLB溶液，逐滴、缓慢加入到C溶液上表面；（5）将含有芽孢悬液的A溶液逐滴、缓慢加入到B溶液上表面，加入完后芽孢悬液在B液的上层；（6）将含有A、B、C三层溶液的离心管放入具有水平转子的冷冻离心机离心；（7）将离心后的离心管取出置于冰上，可以看到离心管内分为明显的上、中、下三层，用吸管缓慢吸出上、中、下三层中的物质，随后用相差显微镜镜检观察，其中上层为细菌营养体，中层为萌发的芽孢，下层为未萌发芽孢。2.根据权利要求1所述的快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法，其特征在于：所用枯草芽孢杆菌菌种为Bacillussubtilis168，购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），菌株编号1.1088。3.根据权利要求1所述的快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法，其特征在于：步骤a中B.subtilis168菌株的活化方法如下：将新鲜枯草芽孢杆菌菌株B.subtilis168接种到20mLLB肉汤培养基中，于37℃、200rpm培养24h对菌种进行活化，标记为一代。4.根据权利要求1所述的快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法，其特征在于：步骤b中将细菌悬液转接到促芽孢生长培养基DSM中在180‑200rpm、36‑38℃的条件下培养20‑24h。5.根据权利要求1所述的快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法，其特征在于：步骤b中细菌悬液与促芽孢生长培养基DSM的体积比为1:100。6.根据权利要求1所述的快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法，其特征在于：步骤b中促芽孢生长培养基DSM的制备方法：A液：970mL去离子水中加入营养肉汤培养基8‑12g，质量分数为1.2%MgSO4溶液8‑10mL、质量分数为10%的KCl溶液8‑12mL、浓度为1M的NaOH溶液0.5mL定容至1L，高压灭菌；B液：浓度为1M的Ca(NO3)2溶液、浓度为1M的MnCl2溶液、浓度为1M的FeSO4溶液，通过0.22μm无菌滤膜除菌；使用时待A液冷却至室温后，分别取1‑1.2mLB液中三种组分加入到A液即可。7.根据权利要求1所述的快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法，其特征在于：步骤c中的离心收集是在6000‑8000rpm、3‑4℃的条件下离心8‑10min。2CN114806943A权利要求