枯草芽孢杆菌的分离纯化与鉴定.pdf

枯草芽孢杆菌的分离纯化与鉴定

枯草芽孢杆菌的分离纯化与鉴定
一、目的：
掌握芽孢杆菌属常见种的分离，鉴定方法和技术。将土壤样品中
分离的芽孢杆菌属未知种鉴定到属。
二、原理：
芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不会失去生理活性，但是不
能产生芽孢的细菌会失去活性。，因而得到芽孢菌属，经过进一步分
离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。
三、材料和器皿：
显微镜、培养皿（12个）、试管（12个）、三角瓶（5个）、烧
杯、移液管（）、涂布棒（6个）、载玻片、接种环、接种针、试管架、
灭菌锅、培养箱
培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、淀粉培养基、v.p.实验培养基、肉
汤琼脂培养基
孔雀绿溶液、番红复染液、NaOH溶液、草酸铵溶液、碘液、乙
醇
四、操作步骤
菌种的分离和纯化
（1）土壤的采集：取土壤表层5~10厘米下的肥土100g左右，
把采得的土壤放入纸袋中带回实验室分离。
（2）平板的制备：融化三角瓶中的牛肉膏蛋白胨培养基，以每皿
20ml左右倒入6个平板上。
（3）稀释分离法：秤取土壤5g放入含有45ml水的三角瓶中，
摇动片刻，然后将此瓶用小火加热至悬浊液沸腾，维持15分钟，而后
静止5分钟。吸取上层液0.5ml
加入到含有4.5ml的无菌水的试管中，制成1:100浓度的悬液，
然后分别吸取
10-2和10-3土壤悬浊液个0.1ml滴加到上述牛肉膏蛋白胨培养
基平板上，每种
稀释2皿，用涂布棒均匀涂布，并将培养基倒置于37℃恒温培养
1~2天。
（4）挑菌及纯化：从上述分离的平板上分别挑取2个单菌落中部
分菌落，然后在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化，经菌落特征的观察
和镜检，确定是否是芽孢杆
菌纯种后，从中选择一株转接于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，置
37℃培养1~2
天备用。
菌种的鉴定
1、形态的观察（形状、颜色、质地、透明度等）
（1）单个菌种的形态
（2）菌种形态的观察
2.革兰氏染色
3.芽孢染色
4.菌体大小测验
5.枯草芽孢杆菌的生理生化鉴定
一、淀粉水解
一、原理
许多芽孢杆菌产生淀粉酶，能将淀粉培养基中的淀粉水解成无色
糊精等小分子物质或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖，淀粉水解后，遇
碘不再变蓝色。
二、培养基及试剂
培养基：肉汤琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分装于三瓶。
0.1mpa，20min灭菌
试剂：卢哥尔氏碘液
三、步骤
将培养基融化后，冷却至50‘C左右，倒成平板，凝固后取菌种，
点种于平板上，每皿点钟2点，一般于30’C培养2—4天，形成菌
落后，在平板上滴加卢哥氏碘液，以铺满菌落为度，平板成蓝色，而
菌落周围如有五色透明圈出现，说明淀粉被水解，透明圈的大小，可
说明水解能力的大小。
附：培养基配方
肉汤琼脂培养基：
牛肉膏1g
蛋白胨2g
NACL1g
琼脂3.6g
蒸馏水200ml
葡萄糖2g
PH7.0-7.2
121’C灭菌20min
二．过氧化氢酶测定
一、原理：
H2O2酶能催化H2O2分解成水和氧。
二、试剂：
3~10%H2O2培养基:肉汤琼脂培养基
三、操作步骤：
将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，30℃培养1—2天。取一干
净载玻片，在上面滴一滴3~10%H2O2，挑取一环培养1—2天的菌
苔在H2O2溶液中涂抹，若有气泡出现，记作H2O2酶阴性。
三.明胶水解实验
一.原理：
明胶是一种动物性蛋白质，枯草芽孢杆菌所产生的蛋白酶课分解
明胶，明胶被分解后，其分子变小，虽然在低于20℃的温度下，也不
再凝固。
二.操作步骤：
1.取3支明胶培养基试管，用记号笔标明各试管欲接种的菌名。
2.用接种环分别穿刺接种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄
球菌。
3.将接种后的试管置于20℃中培养2~5天、
4.观察明胶液化情况。
四.糖发酵试验
一.原理：
绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质
的能力上有很大差别，有些细菌能分解某种糖产生有机酸和气体，有
些细菌只产酸不产气。发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、
倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可
由紫色转变为黄色。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来
证明。
二.培养基
培养基：葡萄糖发酵培养基试管和乳糖培养基试管各2支（内装
有倒置的德汉氏小管）。
三.操作步骤：
1.用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基的名称和所接种
的细菌菌名。
2.取葡萄糖发酵培养基试管2支，接入枯草芽孢杆菌，另一只不接
种，作为对照。另取乳酸发酵培养基试管2支，同接入枯草芽孢杆菌，
另一只不接种，作为对照。
3.将接过种和作为对照的4支试管均置37℃中培养24~48小时。
4.观察个试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。