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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106501521A(43)申请公布日2017.03.15(21)申请号201610919191.0(22)申请日2016.10.21(83)生物保藏信息CCTCCNO:C20161402016.07.31(71)申请人河北省科学院生物研究所地址050051河北省石家庄市友谊南大街46号2号楼509(72)发明人李春生刘静静李玉静吴萌杜顺丰武孝利曹秀梅闫玉杰(74)专利代理机构河北东尚律师事务所13124代理人李国聪(51)Int.Cl.G01N33/577(2006.01)G01N33/543(2006.01)G01N33/535(2006.01)权利要求书3页说明书10页附图2页(54)发明名称一种检测呋喃唑酮代谢物的酶联免疫试剂盒及其制备方法与应用(57)摘要本发明涉及一种检测呋喃唑酮代谢物的酶联免疫试剂盒及其制备方法与应用,属于免疫学技术领域和兽药残留分析技术领域。该检测呋喃唑酮代谢物的酶联免疫试剂盒含有包被有呋喃唑酮代谢物抗原的酶标板、呋喃唑酮代谢物单克隆抗体、酶标记物、呋喃唑酮代谢物标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、样本复溶液。该酶联免疫试剂盒具有灵敏度、精密度、准确度高,交叉反应率高,稳定性好储存时间长,操作简单,快速,适合大批量样品初筛等优点。CN106501521ACN106501521A权利要求书1/3页1.一种检测呋喃唑酮代谢物残留的酶联免疫试剂盒,其特征在于,该酶联免疫试剂盒由包被有呋喃唑酮代谢物抗原的酶标板、呋喃唑酮代谢物单克隆抗体、酶标记物、呋喃唑酮代谢物标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、样本复溶液组成。2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒,其特征在于,所述呋喃唑酮代谢物单克隆抗体为鼠源单克隆抗体,由CCTCCNO:C2016140的杂交瘤细胞株AOZ-4G3产生;该杂交瘤细胞株被命名为杂交瘤细胞株AOZ-4G3,于2016年7月31日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏,保藏号为CCTCCNO:C2016140。3.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒,其特征在于,所述呋喃唑酮代谢物单克隆抗体由呋喃唑酮代谢物抗原产生,该呋喃唑酮代谢物抗原为由呋喃唑酮代谢物与载体蛋白采用碳化二亚胺法合成的偶联物,包括免疫原与检测原;所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清白蛋白、免疫血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白。4.根据权利要求3所述的酶联免疫试剂盒,其特征在于,所述呋喃唑酮代谢物免疫原使用牛血清白蛋白为载体;所述呋喃唑酮代谢物检测原使用卵清蛋白为载体。5.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒,其特征在于,所述酶标记物为酶标记抗抗体,该酶标记抗抗体为辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗抗体,其采用碘酸钠法将标记酶辣根过氧化物酶与羊抗鼠抗抗体偶联得到。6.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒,其特征在于,所述呋喃唑酮代谢物标准品溶液的浓度分别为0ug/L、0.1ug/L、0.3ug/L、0.9ug/L、2.7ug/L、8.1ug/L;所述底物显色液由底物A和底物B组成,底物A为过氧化氢或过氧化脲,底物B为邻苯二胺或四甲基联苯胺,底物A和底物B按体积比1:1混合均匀;所述终止液为1-2mol/L的硫酸溶液;所述浓缩洗液为含有1%吐温-20的0.2mol/LPH7.4的磷酸缓冲液;所述样本复溶液为含有0.1-5%脱脂奶粉的0.02mol/LPH7.4的磷酸缓冲液。7.一种制备权利要求1至6任一权利要求所述的酶联免疫试剂盒制备方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)制备呋喃唑酮代谢物抗原工作液:(a)呋喃唑酮代谢物衍生化:取0.25gAOZ,用2mL左右的甲醇于室温下搅拌使之溶解;取0.15g3-羧基苯甲醛,用2mL甲醇使之溶解,在搅拌下缓慢滴入上述AOZ溶液中,室温下搅拌反应5h,过滤,烘干滤渣即得呋喃唑酮代谢物的衍生物CPAOZ;(b)免疫原的合成:称取50mg的牛血清白蛋白BSA溶于pH值7.4的1mL0.1mol/L的PBS中,加入N,N-二甲基酰胺DMF1mL,搅拌溶解;再将步骤(a)所得的CPAOZ8mg溶于1mLDMF溶液中,搅拌下加入二环己基亚胺DCC14mg和N-羟基琥珀酰亚胺NHS6mg,4℃下密封搅拌过夜,8000r/min离心15分钟,收集上清液装入透析袋中,4℃条件下用pH值7.4的0.01mol/LPBS透析3d,每天换液3-4次,得CPAOZ-BSA溶液;(c)检测原的合成:称取40mg的卵清蛋白OVA溶于pH值7.4的1mL0.1mol/LPBS中,加入N,N-二甲基酰胺DMF1mL,搅拌溶解;再将步骤(a)所得的CPAOZ8mg溶于1mLDMF溶液中,搅拌下加入二环己基亚胺DCC1