链霉菌重组质粒pIJ8600‑attM及其构建方法和其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106591348A(43)申请公布日2017.04.26(21)申请号201610697539.6C12R1/01(2006.01)(22)申请日2016.08.19C12R1/465(2006.01)(71)申请人东南大学地址211189江苏省南京市江宁区东南大学路2号(72)发明人林岚(74)专利代理机构南京瑞弘专利商标事务所(普通合伙)32249代理人陈国强(51)Int.Cl.C12N15/76(2006.01)C12N15/66(2006.01)C12N1/21(2006.01)A01N63/02(2006.01)A01P1/00(2006.01)权利要求书2页说明书9页序列表2页附图3页(54)发明名称链霉菌重组质粒pIJ8600-attM及其构建方法和其应用(57)摘要本发明公开了一种链霉菌重组质粒pIJ8600-attM及其构建方法和其应用，该重组质粒是基于大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pIJ8600，采用限制性酶切以及DNA连接原理，插入了功能性的解酯酶基因attM片段构建而成。该质粒用于链霉菌群体感应分子γ-丁内酯的降解,因此可应用于基于群感淬灭的动植物放线菌病原体的防治、同时用于空气、水体等环境中抑制某些放线菌所产次生代谢物或者生物膜。该质粒降解丁内酯的后续用途是基于链霉菌同源重组的基因表达，相较于其它物理、化学方法，成本低廉，无残留，环境友好。CN106591348ACN106591348A权利要求书1/2页1.一种重组质粒，其特征在于：所述质粒是基于大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pIJ8600，采用限制性酶切以及DNA连接原理，插入了功能性的解酯酶基因attM片段构建而成；它包含来源于pUC18质粒的DNA复制起点(ori)、便于在大肠杆菌与链霉菌中筛选的阿泊拉霉素(Apra)抗性标记aac(3)IV、便于接合DNA转移到受体细胞的源于RK2质粒的转移起点(oriT)、多个限制性酶切位点组成的多克隆位点(MCS)、紧挨着多克隆位点(MCS)上游的由硫链丝菌素诱导驱动的强启动子tipAp以及位于多克隆位点(MCS)下游的转录终止子tfd以防止转录的通读；它还包含如上所述的解酯酶基因attM。2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于：所述多个限制性酶切位点包括NdeI，XbaI,BamHI,BglII。3.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于：所述解酯酶基因attM的核苷酸序列见DNA序列数据库Genbank，登录号U59485，该基因全长为771bp，G+C含量为57％，编码256个氨基酸的解酯酶蛋白。4.一种根据权利要求1所述的重组质粒的构建方法，其特征在于：经PCR扩增从根癌农杆菌AgrobacteriumtumefaciensC58菌株得到的解酯酶基因attM编码区序列(CDS)与NdeI/BglII双酶切后的pIJ8600载体进行连接，获得携带attM的重组质粒pIJ8600-attM，插入的attM编码序列置于tipAp启动子之下，受硫链丝菌素的驱动而表达。5.根据权利要求4所述的重组质粒的构建方法，其特征在于：该构建方法的具体步骤为：步骤a，attM基因片段的克隆：采用逆转录-PCR技术从根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)C58中扩增得到；用质量浓度1％琼脂糖凝胶电泳切胶回收目的条带，其中，琼脂糖凝胶电泳采用DNA凝胶回收试剂盒，DNA溶于pH为8.0、浓度为10MTris-HCl缓冲液中，贮于-20℃；步骤b，限制性酶切：上述纯化的PCR产物进行NdeI和BglII双酶切,酶切产物经质量浓度1％琼脂糖凝胶电泳、切胶回收；pIJ8600质粒用NdeI和BglII双酶切；酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳、切胶回收；步骤c，酶切的pIJ8600质粒与attM基因的连接：酶切的attM基因片段与同样酶切的pIJ8600质粒进行DNA连接，16℃温育过夜；步骤d，转化大肠杆菌DH5α克隆宿主：上述全量连接反应产物通过化学转化法转入E.coliDH5α中；步骤e，菌落PCR以及测序验证：挑取LB/Apra平板上转化子10个，振荡培养6–8h,取1μl菌液作为模板进行菌落PCR鉴定；经菌落PCR鉴定正确的转化子进行所插入基因attM的测序。6.一种根据权利要求1所述的重组质粒在链霉菌QS信号分子γ-丁内酯的降解中的应用。7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：包括：(1)将其转化非致病性链霉菌(non-pathogenicStreptomycetes)，然后返接到敏感宿主，以携带pIJ8600-attM质粒的非致病性链霉菌为媒介，发挥群感淬灭作用，精准摧毁病原2CN106591348A权利要求书2/