交联脱细胞羊膜及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106860919A(43)申请公布日2017.06.20(21)申请号201710090417.5(22)申请日2017.02.20(71)申请人广州润虹医药科技有限公司地址510730广东省广州市广州经济技术开发区永和经济区永盛路10号（6）栋第5层(72)发明人车七石(74)专利代理机构广州华进联合专利商标代理有限公司44224代理人王雯雯曾云腾(51)Int.Cl.A61L27/60(2006.01)A61L27/36(2006.01)C12N5/071(2010.01)权利要求书2页说明书10页附图3页(54)发明名称交联脱细胞羊膜及其制备方法和应用(57)摘要本发明涉及一种交联脱细胞羊膜、复合型皮肤替代物及其制备方法和应用。所述交联脱细胞羊膜的制备方法包括如下步骤：将脱细胞羊膜浸泡于MES缓冲液中，加入水溶性碳二亚胺浓度为0.01-0.1mmol/mg，交联反应1-10min，清洗，真空冷冻干燥即得。本发明制备获得的交联脱细胞羊膜保留了基底膜的细胞因子，同时机械强度增强。本发明获得脱细胞羊膜作为培养基质制备的复合型皮肤替代物，能够用于创面修复。CN106860919ACN106860919A权利要求书1/2页1.一种交联脱细胞羊膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)浸泡：将脱细胞羊膜浸泡于25-35mlMES缓冲液中55-65min；(2)交联反应：向浸泡后的羊膜所在的缓冲液中加入水溶性碳二亚胺，并使碳二亚胺的浓度为0.01-0.1mmol/mg，置于37±0.5℃的恒温摇床上，转速28-32rpm，交联反应1-10min；(3)蒸馏水清洗，真空冷冻干燥，即得。2.根据权利要求1所述的交联脱细胞羊膜的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述脱细胞羊膜由以下步骤制备而成：在无菌条件下，从胎盘的内层剥下羊膜，放置到无菌生理盐水中，反复冲洗去除羊膜表面的脏污，并去除所述羊膜的绒毛膜，用pH为7.2-7.4的PBS溶液反复漂洗；将漂洗后的羊膜在抗生素溶液中浸泡3-7min，再在pH为7.2-7.4的PBS溶液浸泡8-12min，此过程重复多次；用pH为7.2-7.4的PBS溶液重新冲洗后，置于含DMEM：甘油体积比为1：0.5-2的溶液中，-80℃条件下储存6-8个月；取无感染的储存所得羊膜，4℃条件下，置于在质量百分比为0.1％-0.5％的trypsin-EDTA水溶液中孵育过夜；再用含有血清的DMEM培养基对其进行终止消化，用pH为7.2-7.4的PBS溶液冲洗多次，备用。3.根据权利要求2所述的交联脱细胞羊膜的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述脱细胞羊膜的制备过程，还包括复苏的步骤：将无感染的储存6-8个月的所述羊膜预先依次置于-80±5℃和37±2℃环境中反复冻融2-4次后，备用。4.由权利要求1、2或3所述的交联脱细胞羊膜的制备方法制备而成的交联脱细胞羊膜。5.权利要求4所述的交联脱细胞羊膜在制备具有创面修复功效的复合型皮肤替代物中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述复合型皮肤替代物的制备过程包括如下步骤：将权利要求4所述的交联脱细胞羊膜制成片状，将片状的所述交联脱细胞羊膜的基质所在面贴于培养皿的底部，置于培养箱中；将表皮细胞以1×105的接种量接种于所述交联脱细胞羊膜的非基质所在面，加入皮肤培养基G进行培养；所述培养基G的配方为：450mLDMEM/F12培养基、50mLFBS、0.01-1μmol/L胰岛素、0.01-1mmol/mL非必需氨基酸、10-50ng/mLhEGF、100IU/mL青霉素、15-50μg/mLBPE和100-500μg/mL氯化钙；每天更换培养液，培养6-8天，即得所述复合型皮肤替代物。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述表皮细胞由尿液细胞经诱导培养而成，其诱导培养的过程如下：S1，从尿液中提取尿细胞；S2，将所述尿细胞培养为iPS细胞；S3，将所述iPS细胞诱导培养获得间充质干细胞；S4，将所述间充质干细胞诱导培养，即得所述表皮细胞。2CN106860919A权利要求书2/2页8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在步骤S1中，所述尿细胞的融合度不小于80％。9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在步骤S2中，所述iPS细胞的融合度不小于90％。10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在步骤S3中，所述间充质干细胞的融合度不小于90％。3CN106860919A说明书1/10页交联脱细胞羊膜及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明涉及组织工程技术领域，特别是涉及一种交联脱细胞羊膜及其制备方法和应用。背景技术[0002]真皮替代物的研究一直是组