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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106916857A(43)申请公布日2017.07.04(21)申请号201710138579.1(22)申请日2017.03.09(71)申请人浙江大学地址310013浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号(72)发明人杨立荣周海胜蒙丽钧尹新坚徐刚吴坚平(74)专利代理机构杭州天勤知识产权代理有限公司33224代理人蒋琼(51)Int.Cl.C12P13/04(2006.01)权利要求书1页说明书13页序列表3页附图4页(54)发明名称一种生产L-草铵膦的方法(57)摘要本发明公开了一种生产L-草铵膦的方法,该方法以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物,经酶催化体系催化获得L-草铵膦,所述酶催化体系由γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和辅酶再生系统组成。本发明方法在利用转氨酶催化活力高、立体选择性强等优点的同时,解决了转氨酶催化反应不彻底的难题,使催化反应能完全地将底物2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸转化为L-草铵膦,转化率可达100%;本发明方法的最终产品中没有副产物a-酮戊二酸的积累,反应结束时产品中其他物质如原料谷氨酸的残留量极低,从而极大地简化了L-草铵膦的后续精制工艺,提高了产品总收率。CN106916857ACN106916857A权利要求书1/1页1.一种生产L-草铵膦的方法,其特征在于,以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物,经酶催化体系催化获得L-草铵膦,其特征在于,所述酶催化体系由γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和辅酶再生系统组成。2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述酶催化体系中的γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和辅酶再生酶为离体酶、固定化酶或工程菌表达的酶。3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶来源于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌。4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶来源于大肠杆菌(E.coli)K12W3110、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168或巨大芽孢杆菌(Bacillusmagaterium)YYBM1。5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述谷氨酸脱氢酶来源于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或假单胞菌。6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述谷氨酸脱氢酶来源于大肠杆菌(E.coli)K12W3110或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168或假单胞菌(Pseudomonasentomophilastr.)L48。7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述辅酶再生系统为:以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶、以葡萄糖为辅酶再生底物、包含NADH和NAD+的葡萄糖脱氢酶辅酶再生系统;或,以醇脱氢酶为辅酶再生酶、以异丙醇为辅酶再生底物、包含NADH和NAD+的醇脱氢酶辅酶再生系统;或者,以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶、以甲酸盐为辅酶再生底物、包含NADH和NAD+的甲酸脱氢酶辅酶再生系统。8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述葡萄糖脱氢酶来源于巨大芽胞杆菌;所述醇脱氢酶来源于乳酸杆菌;所述甲酸脱氢酶来源于博伊丁假丝酵母。9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,催化体系中,以酶活力为单位,所述γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和辅酶的添加量均为100~100000U/L。2CN106916857A说明书1/13页一种生产L-草铵膦的方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域,具体地说,是关于一种生物酶法生产光学纯L-草铵膦的新方法。背景技术[0002]草铵膦,也称草丁膦,英文名为:Phosphinothricin(简称PPT),化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸。草铵膦是由Hoechst公司于80年代开发的(后归属于拜耳公司)广谱灭生性除草剂。[0003]众所周知,灭生性除草剂市场巨大,占整个除草剂市场的六七成,尤其是在热带、亚热带地区,使用量巨大。目前世界三大除草剂分别为草甘膦、百草枯和草铵膦。在市场使用量方面,草甘膦独占鳌头,近年来全球年使用量在85万吨左右;百草枯紧随其后,2015年的市场份额10万吨左右;而目前草铵膦产量很小,2015年国内产能只有0.6-0.7万吨。[0004]然而,前两大除草剂都遇到了极大的问题:草甘膦的长期大量使用,一是造成大量杂草产生抗性,使草甘膦趋于失效;二是造成严重水土流失和土壤板结;百草枯由于其剧毒性,已被列入《鹿特丹公约》,全球越来越多国家禁用或限用,中国农业部等多部委联合发布的1745号公告已说明,百草枯水剂在2014年7月1日停止生产,2016年7月1日禁止使用。百草枯退市后,其国内