干细胞培养上清凝胶组合物及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107308441A(43)申请公布日2017.11.03(21)申请号201710451536.9A61K47/38(2006.01)(22)申请日2017.06.15A61P17/02(2006.01)C12N15/70(2006.01)(71)申请人江苏迈健生物科技发展股份有限公C12N15/12(2006.01)司A61K35/28(2015.01)地址214000江苏省无锡市惠山经济开发区惠山大道1699号无锡（惠山）生命科技园C区1号楼401-411室(72)发明人冷晓燕张超段云飞徐燕常菁虞强(74)专利代理机构南京经纬专利商标代理有限公司32200代理人黄欣(51)Int.Cl.A61K38/18(2006.01)A61K9/06(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表1页附图1页(54)发明名称干细胞培养上清凝胶组合物及其制备方法和应用(57)摘要本发明提供了一种干细胞培养上清凝胶组合物及其制备方法和应用，该凝胶组合物由干细胞培养上清、人表皮生长因子蛋白和甲基纤维素组成，溶剂为水；所述干细胞培养上清是将间充质干细胞使用不含血清的干细胞培养基培养后收集纯化得到；所述人表皮生长因子蛋白是将人表皮生长因子基因序列优化后诱导表达得到。本发明将无血清培养上清和人表皮生长因子基因优化后得到的蛋白结合，所得的凝胶组合物用于皮肤创面修复，效果显著，且不留瘢痕。CN107308441ACN107308441A权利要求书1/1页1.干细胞培养上清凝胶组合物，其特征在于：由干细胞培养上清、人表皮生长因子蛋白和甲基纤维素组成，溶剂为水；所述干细胞培养上清是将间充质干细胞使用不含血清的干细胞培养基培养后收集纯化得到；所述人表皮生长因子蛋白是将人表皮生长因子基因序列进行优化后诱导表达得到。2.根据权利要求1所述的干细胞培养上清凝胶组合物，其特征在于：所述人表皮生长因子基因序列进行优化后的序列如SEQIDNO.1所示。3.权利要求1或2所述的干细胞培养上清凝胶组合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1，将间充质干细胞使用不含血清的干细胞培养基培养，收集上清液，离心，在所得上清中加入硫酸铵，搅拌、静置，离心，取沉淀，加水溶解，过滤，得蛋白滤液；步骤2，将步骤1所得蛋白滤液经凝胶柱纯化，然后冻干，得到冻干上清；步骤3，对人表皮生长因子基因的编码区进行大肠杆菌密码子偏爱性的基因优化，在所得优化序列N端和C端分别加上NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，对得到的合成序列进行全基因合成，并连入原核表达载体pET-30a得到重组的原核表达质粒pET-30a-hEGF；步骤4，将步骤3所得重组质粒转化到大肠杆菌中，诱导表达后得到以包涵体形式表达的人表皮生长因子蛋白，经分离纯化后得到人表皮生长因子蛋白；步骤5，将步骤2所得冻干上清用无菌水溶解，所得水溶液与人表皮生长因子蛋白水溶液、甲基纤维素水溶液混合，得到干细胞培养上清凝胶组合物。4.根据权利要求3所述的干细胞培养上清凝胶组合物的制备方法，其特征在于：步骤1中加入硫酸铵步骤在0℃冰浴中进行。5.根据权利要求3所述的干细胞培养上清凝胶组合物的制备方法，其特征在于：步骤1中静置条件为4℃、12h-16h。6.根据权利要求3所述的干细胞培养上清凝胶组合物的制备方法，其特征在于：步骤2中采用的凝胶柱为葡聚糖G-25凝胶柱，洗脱剂为0.1M-0.15MNaCl水溶液。7.根据权利要求3所述的干细胞培养上清凝胶组合物的制备方法，其特征在于：步骤5中冻干上清水溶液的浓度为19mg/mL，人表皮生长因子蛋白水溶液的浓度为160-640ng/mL，甲基纤维素水溶液的质量浓度为3%。8.权利要求1所述的干细胞培养上清凝胶组合物在皮肤创面修复中的应用。2CN107308441A说明书1/5页干细胞培养上清凝胶组合物及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于医用生物材料技术领域，具体涉及一种干细胞培养上清凝胶组合物及其制备方法和应用。背景技术[0002]创面的愈合过程是一个复杂的过程，它涉及到皮肤缺损部位的再上皮化、肉芽组织的增生、炎症反应、血管增生和创面的重塑等过程，其中任何一个过程出现问题，都会导致创面愈合障碍。目前，修复创面的方法主要是手术，即将开放创口通过手术缝合转变为闭合伤口，从而加速创面愈合，但术后遗留疤痕、伤口张力过大出现复裂或愈合后出现功能障碍等并发症。对于一些较为复杂的创面，如放射性创面、糖尿病足、长期使用激素后的创面等，这些创面常常出现局部血液循环障碍、成纤维细胞的生物活性降低、间充质干细胞的分化和旁分泌作用受抑制等负面影响，使得创面表皮再生缓慢、炎症反应降低、创面抗感染能力下降，即便创面较小，采用植皮或直接缝合的方法闭