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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107449898A(43)申请公布日2017.12.08(21)申请号201710560230.7(22)申请日2017.07.11(71)申请人中检国研(北京)科技有限公司地址100123北京市朝阳区高碑店北路甲三号2号楼4层403室(72)发明人邹明强齐小花赵兵洁(51)Int.Cl.G01N33/533(2006.01)权利要求书2页说明书6页附图4页(54)发明名称一种卡那霉素残留荧光免疫层析试纸及其制备方法(57)摘要本发明公开了一种卡那霉素残留荧光免疫层析检测试纸及制备方法。包括样品垫,抗体结合垫,NC纤维素膜,吸水纸,自下而上依次通过带有粘合剂的底板互相搭接而成,所述NC纤维素膜上从靠近抗体结合垫一端依次为包被检测线T线和质控线C线。所述抗体结合垫承载荧光标记抗体的结合物,所述NC纤维素膜自上而下分别设有用偶联包被抗原Kana-BSA喷划的T线和用羊抗鼠二抗IgG喷划的C线,荧光标记探针为稀土荧光二氧化硅纳米颗粒,荧光标记探针以醛基葡聚糖作为交联试剂与抗体结合;利用凝胶成像系统和荧光读卡仪考察荧光免疫层析试纸条的制备条件,利用荧光读卡仪检测T线的荧光强度,通过卡那霉素抗原浓度的标准曲线完成定量检测。CN107449898ACN107449898A权利要求书1/2页1.一种卡那霉素残留荧光免疫层析试纸及其制备方法,包括样品垫,抗体结合垫,NC纤维素膜,吸水纸,自下而上依次通过带有粘合剂的底板互相搭接而成,其特征在于,所述NC纤维素膜上从靠近抗体结合垫一段分别依次包被检测线和质控线,所述抗体结合垫承载荧光标记抗体的结合物,所述NC纤维素膜自上而下分别设有用偶联抗原喷划的检测线T线和用羊抗鼠二抗IgG喷划的质控线C线,其特征在于,荧光标记探针为稀土荧光二氧化硅纳米3+颗粒BHHCT-Eu@SiO2,荧光标记探针以醛基葡聚糖作为交联试剂与抗体结合,利用凝胶成像系统和荧光读卡仪考察荧光免疫层析试纸条的制备条件,利用荧光读卡仪检测T线的荧光强度,通过卡那霉素抗原浓度的标准曲线完成定量检测。2.根据权利要求1所述的卡那霉素残留荧光免疫层析试纸,其特征在于,所述的荧光标3+记探针为稀土荧光二氧化硅纳米颗粒BHHCT-Eu@SiO2,由以下方法制备:(1)二氧化硅纳米颗粒的制备:取环己烷6mL、Tx-1002.13mL、正辛醇1.87mL和0.6mL超纯水加入锥形瓶中,磁力搅拌,待搅拌均匀后,依次加入100μLTEOS和60μL氨水,室温搅拌24h,得到SiO2纳米微乳液。(2)二氧化硅纳米颗粒表面氨基化:取3μL3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMs)加入到(1)中得到的SiO2纳米微乳液中,微波加热,微波功率700W,温度70℃,反应时间考察20min。(3)BHHCT-Eu3+荧光稀土络合物的合成:将5mg4,4′-二(1″,1″,1″,2″,2″,3″,3″-七氟-4″,6″-己二酮-6”-基)-氯磺酰-邻-三联苯(BHHCT)溶于700μL无水乙醇,加入4.84μLEu3+(0.64mol/L),制得荧光稀土络合物。(4)BHHCT-Eu3+修饰的二氧化硅荧光纳米颗粒的制备:将步骤(3)中得到荧光络合物加入到(2)中微乳液体系,微波加热,微波功率700W,温度59℃,反应时间考察20min。加入5mL丙酮,混匀,离心,再用乙醇/水(v∶v,1∶1)洗涤颗粒3次,最后用无水乙醇洗涤颗粒1次,离心,烘干,即得产物荧光稀土二氧化硅纳米颗粒。3.根据权利要求1所述的卡那霉素残留荧光免疫层析试纸条,其特征在于,所述荧光标记抗体结合物(简称荧光标记抗体)是以醛基化葡聚糖作为交联剂,将荧光标记探针与抗体进行交联,形成荧光标记抗体,具体方法如下:(1)200mg葡聚糖,溶于0.03M高碘酸钠5ml溶液,避光,室温反应过夜。然后用超纯水透析过夜,除去未反应的小分子,4℃储存备用。(2)取卡那霉素抗体,以25mMpH8.0碳酸缓冲液(简称CBS)透析过夜。3+(3)取制备好的Eu-BHHCT@SiO2荧光纳米颗粒4mg悬浮于400μL25mMpH9.6的碳酸盐缓冲液中,再加入400μL醛基化葡聚糖,避光反应7h。以25mMpH9.6的碳酸盐缓冲液洗涤3遍,悬浮于200μL25mMpH9.6的碳酸盐缓冲液中。(4)将透析好的卡那抗体200μL与上述醛基葡聚糖修饰的荧光纳米粒子混合,4℃反应过夜。加硼氢化钠,终浓度为5mM,4℃反应4h,再加等体积的50mMpH7.8Tris-HCl(含2%BSA,4%蔗糖)封闭液封闭12h。(5)最后用50mMpH7.8Tris-HCl洗涤颗粒3遍,然后用100μL50mMpH7.8Tris-HCl(含0.9%NaCl,0.2%BS