在细胞内产生点突变的融合蛋白、其制备及用途.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107522787A(43)申请公布日2017.12.29(21)申请号201710451424.3C12N15/62(2006.01)(22)申请日2017.06.15C12N15/63(2006.01)C12N15/90(2006.01)(66)本国优先权数据201610423512.82016.06.15CN(71)申请人中国科学院上海生命科学研究院地址200031上海市徐汇区上海市岳阳路319号(72)发明人常兴(74)专利代理机构上海专利商标事务所有限公司31100代理人韦东(51)Int.Cl.C07K19/00(2006.01)C12N9/78(2006.01)权利要求书2页说明书20页C12N9/22(2006.01)序列表66页附图12页(54)发明名称在细胞内产生点突变的融合蛋白、其制备及用途(57)摘要本发明涉及在细胞内产生点突变的融合蛋白、其制备及用途。具体而言，本发明提供的融合蛋白含有胞嘧啶脱氨酶和核酸酶活性缺失、保留了解旋酶活性的Cas酶，或由胞嘧啶脱氨酶和核酸酶活性缺失、保留了解旋酶活性的Cas酶形成。本发明还涉及所述融合蛋白的编码序列，含所述编码序列的多核苷酸序列，含所述多核苷酸序列的核酸构建物，相应的宿主细胞，在细胞内产生点突变的方法，以及试剂盒等。采用本发明，能实现定点突变的同时，在特定的基因区获得高的突变效率和多种突变组合。CN107522787ACN107522787A权利要求书1/2页1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白含有胞嘧啶脱氨酶和核酸酶活性缺失、保留了解旋酶活性的Cas酶，或由胞嘧啶脱氨酶和核酸酶活性缺失、保留了解旋酶活性的Cas酶形成。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述Cas酶的核酸酶活性全部缺失，无DNA双链断裂能力，或部分缺失，仅具有DNA单链断裂能力；和/或所述Cas酶选自：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同源物或其修饰形式；优选地，所述Cas酶为Cas9酶，优选选自：来自化脓链球菌的Cas9、来自金黄色葡萄球菌的Cas9，以及来自嗜热链球菌的Cas9；和/或所述胞嘧啶脱氨酶为全长胞嘧啶脱氨酶、或其保留了酶活的片段或突变体，其中所述片段至少包括胞嘧啶脱氨酶的NLS结构域、催化结构域和APOBEC样结构域；和/或所述融合蛋白还包含以下序列中的一种或多种：接头，核定位序列，以及为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化而引入的氨基酸残基或氨基酸序列。3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述Cas酶为Cas9酶，该酶的两个核酸内切酶催化结构域RuvC1和/或HNH发生突变，导致该酶核酸酶活性缺失、保留了解旋酶活性；优选地，所述Cas9酶的RuvC1和HNH都发生突变，导致该酶核酸酶活性缺失、保留了解旋酶活；更优选地，所述Cas9酶的第10个氨基酸天冬酰胺突变为丙氨酸或其它氨基酸，第841位氨基酸组氨酸突变为丙氨酸或其它氨基酸；更优选地，所述Cas9酶的氨基酸序列如SEQIDNO:2第42－1452所示，或如SEQIDNO:72第42-1419位氨基酸残基所示；和/或所述胞嘧啶脱氨酶的片段至少包含胞嘧啶脱氨酶的第9－182位氨基酸残基，例如至少包含第1－182位氨基酸；优选地，所述片段由第1－182位氨基酸残基组成，由第1－186位氨基酸残基组成，或由第1－190位氨基酸残基组成；或者，所述胞嘧啶脱氨酶的氨基酸序列如SEQIDNO:2第1457－1654位氨基酸所示，所述片段至少包含SEQIDNO:2的第1465－1638位氨基酸残基，例如至少包含SEQIDNO:2第1457－1638位氨基酸残基，优选地，所述片段由SEQIDNO:2第1457－1638位氨基酸残基、SEQIDNO:2第1457－1642位氨基酸残基，或SEQIDNO:2第1457－1646位氨基酸残组成；所述突变体在第10、82和156位具有取代突变，优选地，所述取代突变是K10E、T82I和E156G，更优选地，所述突变体含有如SEQIDNO:68第1447-1629位所示的氨基酸序列，或由如SE