修饰的EGF蛋白，其制备方法及其用途.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111836826A(43)申请公布日2020.10.27(21)申请号201880083629.3(74)专利代理机构广州华进联合专利商标代理(22)申请日2018.10.23有限公司44224代理人黄爱娇(30)优先权数据10-2017-01371322017.10.23KR(51)Int.Cl.10-2017-01371402017.10.23KRC07K14/485(2006.01)10-2018-01250122018.10.19KRA61K8/64(2006.01)A61Q19/08(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日A61Q19/00(2006.01)2020.06.23A61K38/00(2006.01)(86)PCT国际申请的申请数据PCT/KR2018/0125692018.10.23(87)PCT国际申请的公布数据WO2019/083256KO2019.05.02(71)申请人普罗根有限公司地址韩国首尔权利要求书1页说明书13页(72)发明人梁祯允南银珠序列表5页附图12页(54)发明名称修饰的EGF蛋白，其制备方法及其用途(57)摘要本发明涉及修饰的EGF蛋白，其制备方法及其用途。根据本发明的修饰的EGF蛋白与细胞膜结合以致EGF可被有效递送到细胞中，由此提高细胞渗透性和半衰期时间。此外，所述修饰的EGF蛋白甚至在严苛条件下仍保持EGF处于完整形式，随之提高长期稳定性，由此可有效用于由于蛋白质变性而具有短的货架寿命并且难于储存和分配的化妆品组合物和药物组合物中。此外，根据本发明的修饰的EGF蛋白制备方法通过确定最优培养温度和pH条件可以生产具有活性的形式的修饰的EGF蛋白并且由于优异的生产率而可以商业应用。在本发明的一个实施方案中，修饰的EGF蛋白以2.3g/L以上的生产率和75％以上的纯化收率生产，这证明了根据本发明的修饰的EGF蛋白制备方法的优越性。因此，本发明的修饰的EGF蛋白在细胞渗透性、体内持久性和稳定性方面优于常规EGF蛋白，并且因此可用作化妆品CN111836826A组合物或药物组合物。CN111836826A权利要求书1/1页1.具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的修饰的EGF蛋白。2.如权利要求1所述的修饰的EGF蛋白，其特征在于，所述具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的修饰的EGF蛋白由SEQIDNO:5的核苷酸序列编码。3.表达载体，其包含编码如权利要求1所述的修饰的EGF蛋白的多核苷酸。4.宿主细胞，所述宿主细胞用权利要求3所述的表达载体转染而得。5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。6.用于制备修饰的EGF蛋白的方法，所述方法包含以下步骤：1)在35℃至38℃的温度条件下培养生产修饰的EGF蛋白的宿主细胞；及2)在培养温度降至32℃至34℃的温度的状态下培养所述宿主细胞。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)中的培养进行3至8天。8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)中的培养温度为37℃。9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)中的培养在6.8至7.3的pH条件下进行。10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中的培养进行7至12天。11.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中的培养温度为33℃。12.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中的培养在6.8至7.1的pH条件下进行。13.如权利要求6所述的方法，其特征在于，当步骤1)中培养的细胞数目达到6×106至9×106个细胞/ml时降低所述培养温度。14.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)及/或步骤2)中的培养是补料分批培养。15.如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括纯化获得自培养液的修饰的EGF蛋白。16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述纯化通过亲和层析进行。17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，在所述亲和层析中使用蛋白A偶联树脂。18.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。19.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述修饰的EGF蛋白具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列。20.用于改善皮肤状况的化妆品组合物，所述化妆品组合物包含如权利要求1所述的修饰的EGF蛋白作为活性成分。21.如权利要求20所述的化妆品组合物，其特征在于，所述改善皮肤状况选自由以下各项组成的组：抑制皱纹形成、抑制皮肤老化、改善皮肤弹性、皮肤再生、损伤或创伤愈合、角膜再生、减轻皮肤刺激及其组合。22.用于预防或治疗皮肤疾病的药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求