一种肿瘤细胞异种移植斑马鱼模型、其构建方法及应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109744199A(43)申请公布日2019.05.14(21)申请号201711091169.2(22)申请日2017.11.08(71)申请人南京艾莫瑞生物科技有限公司地址210000江苏省南京市玄武大道699-1号(72)发明人何明芳檀爱民王瑞雪李建英(51)Int.Cl.A01K67/027(2006.01)权利要求书1页说明书9页附图6页(54)发明名称一种肿瘤细胞异种移植斑马鱼模型、其构建方法及应用(57)摘要本发明提供一种肿瘤细胞异种移植斑马鱼模型、其构建方法及应用，通过将患者肿瘤组织解离的原代细胞植入斑马鱼的体内，得到患者来源的肿瘤异种移植模型。本发明所建立的肿瘤异种移植模型，保留了临床上人胃癌组织的病理特征，具有更高的临床相关性，可以用于系统地研究肿瘤的增殖、转移、扩散和耐药的机制，以及筛选有效的肿瘤治疗药物。CN109744199ACN109744199A权利要求书1/1页1.一种患者来源的肿瘤细胞异种移植斑马鱼模型，其特征在于该斑马鱼胚胎移植有患者来源的肿瘤组织的原代单细胞。2.根据权利要求1所述的模型，其特征在于所述移植是在受精后24-72小时内进行，进一步优选36-60小时内，更优选在48小时进行。3.根据权利要求1所述的模型，其特征在于所述移植的部位在胚胎卵黄囊。4.根据权利要求1所述的模型，其特征在于所述原代单细胞是经过染色试剂染色的，优选的染色试剂选自CM-Dil。5.根据权利要求1-4所述的模型，其特征在于所述的肿瘤选自胃癌或肺癌。6.根据权利要求1所述的模型在研究肿瘤的增殖、转移、扩散或耐药的机制，或者筛选有效的肿瘤治疗药物中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述筛选包括如下步骤：确定肿瘤候选药物胚胎安全范围内的最高药物浓度；以胚胎安全范围内的药物浓度的候选药物处理所述的斑马鱼胚胎，并选用候选药物的溶解溶剂作为对照药物同法处理；在荧光显微镜下对斑马鱼胚胎中患者来源的细胞的增殖、扩散的情况进行定性分析或/和定量分析。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述定量分析按下式公式计算抗肿瘤效果：药物的肿瘤抑制率＝(药物处理组的荧光强度/对照组的荧光强度)*100％。9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于候选药物处理的时间为持续2到5天，优选3天。10.根据权利要求6-8所述的应用，其特征在于所述的肿瘤选自胃癌，所述药物选自5-氟尿嘧啶。11.根据权利要求6-8所述的应用，其特征在于所述的肿瘤选自肺癌，所述药物选自吉非替尼、顺铂或多西他赛的一种或二种联用。12.一种患者来源的肿瘤细胞异种移植斑马鱼模型的构建方法，包括如下步骤：(1)将患者来源的肿瘤临床手术组织标本解离成原代单细胞；(2)将解离所得的原代单细胞染色；(3)将步骤(2)得到的原代单细胞注射到斑马鱼胚胎卵黄囊内。13.根据权利要求11所述的构建方法，其特征在于：步骤(1)所述的解离包括：将样本在生理盐水中进行无菌清洁后，在磷酸盐缓冲液中剪切成小块，经胰酶消化至解离完全，离心，去除胰酶；步骤(2)所述染色，使用的染料为CM-Dil，染料浓度为1-5μg/ml，染色时间为1-10小时，染色后去除染料，磷酸盐缓冲液洗涤并重悬至细胞密度为5×103-5×105个/μl；步骤(3)所述的注射包括：将受精后36-60小时的斑马鱼胚胎固定，采用显微注射器在体视镜下，将10-30nl，优选为20nl的步骤(2)得到的原代单细胞注射入斑马鱼胚胎卵黄囊内。14.根据权利要求12-13任一项所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤(3)后还包括使用荧光显微镜进行定性分析或/和定量分析的步骤。15.根据权利要求12所述的构建方法，其特征在于在异种移植细胞后的第1-7天内，将斑马鱼胚胎用三卡因麻醉，经荧光显微镜观察荧光细胞在斑马鱼体内的转移和扩散情况。2CN109744199A说明书1/9页一种肿瘤细胞异种移植斑马鱼模型、其构建方法及应用技术领域[0001]本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种患者来源的胃癌异种移植的斑马鱼模型、其构建方法及应用。背景技术[0002]肿瘤疾病已经成为全世界重大的公共卫生问题，最常见的肿瘤有肺癌、胃癌、乳腺癌等。[0003]其中，胃癌是全球最常见的消化系统恶性肿瘤之一，在东亚地区最为高发。世界卫生组织(WHO)公布的《2014年全球癌症报告》数据显示，2012年中国新增的胃癌病例和死亡人数均占全球的40％以上。2016年，美国癌症学会(ACS)主办的权威期刊《CACancerJClin》中新发表的中国2015年癌症统计报告显示，中国2015年胃癌的新发病例为67.91万例，其中，男性新发病例数为47.77万例，位列男性高发癌症的第二位，仅次