一种构建降低高糖诱导斑马鱼细胞凋亡模型的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115820747A(43)申请公布日2023.03.21(21)申请号202211258491.0(22)申请日2022.10.14(71)申请人台州恩泽医疗中心（集团）地址317000浙江省台州市临海市西门街150号(72)发明人曹建斌朱敏淑卢睿顾珊烨项海飞林峰王明仓(74)专利代理机构台州市方信知识产权代理有限公司33263专利代理师孙圣贵(51)Int.Cl.C12N15/873(2010.01)C12N15/89(2006.01)C12N15/12(2006.01)A01K67/027(2006.01)权利要求书2页说明书7页附图4页(54)发明名称一种构建降低高糖诱导斑马鱼细胞凋亡模型的方法(57)摘要本发明涉及一种构建降低高糖诱导斑马鱼细胞凋亡模型的方法，属于基因敲除技术领域。为了解决现有的针对高糖诱导下的斑马鱼模型的构建没有涉及，提供一种构建降低高糖诱导斑马鱼细胞凋亡模型的方法，该方法包括：选择在斑马鱼的tspo基因的第一个外显子上设计靶点，设计tspo基因敲除sgRNA靶点序列，PCR扩增，获得sgRNA体外转录模板；将sgRNA体外转录模板及Cas9配成混合液，于野生型斑马鱼胚胎一细胞期时进行注射，养殖获得F0代斑马鱼；与AB野生型斑马鱼外交获F1代斑马鱼；筛选F1代杂合子斑马鱼，再内交获得F2代斑马鱼并筛选F2代纯合子斑马鱼。构建的模型在高糖诱导后细胞凋亡数目呈现出显著减少的特性。CN115820747ACN115820747A权利要求书1/2页1.一种构建降低高糖诱导斑马鱼细胞凋亡模型的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：A、选择在斑马鱼的tspo基因的第一个外显子上设计靶点，设计斑马鱼tspo基因敲除的sgRNA靶点序列，靶点位正向引物序列设计如下：tspoS2：TTAATACGACTCACTATAGAGGTATAATCACACGGCGGGGTTTTAGAGCTAGAAATAG；tspoS4：TTAATACGACTCACTATAGAAAGGGTGGTCCACACCACTGTTTTAGAGCTAGAAATAG；共用的反向引物T7gRNA‑R：AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC；B、分别使用靶位点正向引物tspoS2和tspoS4，以及共用反向引物T7gRNA‑R，以p‑T7‑gRNA质粒为模板，通过PCR扩增，分别获得相应的tspoS2的sgRNA体外转录模板和tspoS4的sgRNA体外转录模板；C、将上述得到的tspoS2的sgRNA体外转录模板和tspoS4的sgRNA体外转录模板以及Cas9按比例配成混合液后，于野生型斑马鱼胚胎一细胞期时进行显微注射，养殖，获得相应的F0代斑马鱼；D、将F0代斑马鱼养殖至性成熟后与野生AB型斑马鱼外交获得F1代斑马鱼；E、筛选出产生移码突变的稳定遗传的F1代杂合子斑马鱼，将F1代杂合子斑马鱼进行内交，获得F2代斑马鱼，进行基因型分析并筛选出F2代纯合子斑马鱼。2.根据权利要求1所述构建降低高糖诱导斑马鱼细胞凋亡模型的方法，其特征在于，步骤E中所述稳定遗传的F1代杂合子斑马鱼具体为剪切方式为‑5bp的F1代杂合子斑马鱼和剪切方式为‑4‑3bp的F1代杂合子斑马鱼，且将两种剪切方式的F1代杂合子斑马鱼分别进行内交，得到相应的所述F2代斑马鱼。3.根据权利要求1所述构建降低高糖诱导斑马鱼细胞凋亡模型的方法，其特征在于，步骤C中所述tspoS2的sgRNA体外转录模板：tspoS4的sgRNA体外转录模板：Cas9的用量比为320：320：800。4.根据权利要求1所述构建降低高糖诱导斑马鱼细胞凋亡模型的方法，其特征在于，步骤A中还包括检测引物设计，所述检测引物的序列为：tspo‑F1，靶位点上游PCR检测引物：CACAGGCAGTTGCTCAGAATC；tspo‑R1，靶位点下游PCR检测引物：TCTGCAGTAACTAGTCAGTTA。5.根据权利要求4所述构建降低高糖诱导斑马鱼细胞凋亡模型的方法，其特征在于，步骤C之前还包括以下步骤：分别将tspoS2的sgRNA体外转录模板和tspoS4的sgRNA体外转录模板与Cas9按比例配成混合液后，分别于野生型斑马鱼胚胎一细胞期时进行显微注射，养殖至幼鱼时，提取基因组进行PCR测序，检测确认靶点tspoS2和靶点tspoS4的突变效率。6.根据权利要求1或2或3或4所述构建降低高糖诱导斑马鱼细胞凋亡模型的方法，其特征在于，步骤B中所述PCR扩增的反应体系为：10×Buffer：5μL；2CN115820747A权利要求书2/2页10mMdNTP：4μL；TspoS2/S4T7gRNA‑R：2μL；pT7gRNAplasmid：1μL；ext