细菌基因组DNA的提取.pptx

分离纯化核酸总标准：①应确保核酸一级结构完整性；②排除其它分子污染。核酸纯化应到达要求：①核酸样品中不应存在有机溶剂和过高浓度金属离子；②其它生物大分子污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子污染。核酸制备时应注意事项:①尽可能简化操作步骤，缩短提取时间。②降低化学原因对核酸降解。③降低物理原因对核酸降解：机械剪切力和高温④预防核酸生物降解。核酸制备步骤：核酸酶抑制和抑制剂降低温度，改变pH及盐浓度，都利于对核酸酶活性抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更加好。对于DNA，抑制DNase活力很轻易，但预防机械张力拉断则更主要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更主要。DNase抑制①加入少许金属离子螯合剂，如0.01mol/LEDTA或柠檬酸钠，DNase基本能够全部失活。②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。RNase抑制①操作要带手套。②全部器皿要严格消毒，③试剂处理④低温操作⑤在分离过程中要加入一定RNase抑制剂。核酸制备中惯用去垢剂核酸本身带负电荷，结合带正电荷蛋白质。用于核酸提取去垢剂，普通都是阴离子去垢剂，去垢剂作用：1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2．溶解核小体上蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；3．对RNase、DNase有一定抑制作用。核酸制备中惯用蛋白质变性剂1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。3.一些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞作用。核酸制备中惯用酶DNaseRNase蛋白酶K溶菌酶细胞破碎机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；化学试剂法：用SDS处理细胞；酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。DNA提取SDS（十二烷基硫酸钠）法：SDS是有效阴离子去垢剂,细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,SDS能够破坏这种价键。CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法：CTAB是一个阳离子去垢剂，它能够溶解膜与脂膜，使细胞中DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。DNA纯化（去杂质）蛋白质：惯用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。RNA：常选取RNase消化，或是用LiCl来消除大分子RNA。酚类物质：提取液中加少许巯基乙醇，选取幼嫩材料。多糖：提取液中加1％PVP。核酸样品保留温度：4℃（5℃）最正确和最简单-70℃是长久保留良好温度，为一次性保留-20℃保留保留介质：TE缓冲溶液(最惯用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0二、材料、设备及试剂1、培养5ml细菌培养物至饱和状态，取1.2ml培养物离心1rpm,1min。2、沉淀物加入570ul无菌水（或TE）缓冲液，用吸管重复吹打使之重悬。加入30ul10%SDS和10ul20mg/ml蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h，（加入3ul溶菌酶50mg/ml效果更加好）。3、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀，于60℃温育10min。(上下颠倒混匀)，离心，1rpm,5min。4、取上清，加入等体积（约800ul）酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混匀，离心1rpm,5min，将上清液转至新管中。（抽提两次）5、加入0.6体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，静止10分钟，离心,1rpm,10min。6、沉淀用1ml75%乙醇中洗涤，离心5min，弃上清液，重悬于30ul无菌水（或TE）缓冲液。四、注意事项——材料准备四、注意事项——细胞裂解四、注意事项——核酸分离、纯化