诱导性多能干细胞及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110577967A(43)申请公布日2019.12.17(21)申请号201810496335.5C12N5/071(2010.01)(22)申请日2018.05.22C12N5/074(2010.01)C12N5/0789(2010.01)(71)申请人中国人民解放军军事科学院军事医A61K35/44(2015.01)学研究院A61K35/28(2015.01)地址100850北京市海淀区太平路27号A61P9/00(2006.01)申请人华南生物医药研究院(72)发明人裴雪涛裴海云岳文李慧琳聂纪芹曲洺逸范增张博文贾雅丽何丽娟南雪(74)专利代理机构北京清亦华知识产权代理事务所(普通合伙)11201代理人赵天月(51)Int.Cl.C12N15/86(2006.01)C12N5/10(2006.01)权利要求书2页说明书12页附图7页(54)发明名称诱导性多能干细胞及其制备方法(57)摘要本发明提供了诱导性多能干细胞，所述诱导性多能干细胞来源于脐动脉内皮细胞且可以分化为生血内皮细胞。本发明的诱导性多能干细胞保留了部分脐动脉内皮细胞的表观遗传特性，能够分化为血液系统和内皮系统的共祖细胞—生血内皮细胞。由此为造血干细胞移植以及进一步诱导分化获得充足数量的红细胞或血小板乃至各种类型的血液细胞提供来源，也为心血管相关疾病涉及的血管新生提供充足的、具有良好功能的内皮干/祖细胞或成熟的内皮种子细胞，具有较高的应用价值。CN110577967ACN110577967A权利要求书1/2页1.一种诱导性多能干细胞，其特征在于，所述诱导性多能干细胞来源于脐动脉内皮细胞且可分化为生血内皮细胞。2.根据权利要求1所述的诱导性多能干细胞，其特征在于，所述诱导性多能干细胞为非基因组整合式；任选地，所述诱导性多能干细胞是通过将所述脐动脉内皮细胞重编程而获得的；任选地，所述重编程包括将携带有重编程因子的仙台病毒转染至所述脐动脉内皮细胞中；任选地，所述诱导性多能干细胞表达TIE2基因；任选地，与所述脐动脉内皮细胞相比，下列至少之一的基因在所述诱导性多能干细胞内表达水平下调：CD31基因、CD144基因、vWF基因和TIE1基因；任选地，所述生血内皮细胞可分化为下列至少之一的细胞：血系细胞、内皮干/祖细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞；任选地，所述生血内皮细胞可诱导分化为造血干细胞，并可进一步分化为血系细胞，其中，由所述生血内皮细胞向所述血系细胞诱导分化所得到的细胞群中，CD43+细胞含量为35～50％，CD45+细胞含量为15～20％。3.一种药物，其特征在于，含有脐动脉内皮细胞或权利要求1或2所述的诱导性多能干细胞。4.权利要求1或2所述的诱导性多能干细胞在制备药物中的用途，其特征在于，所述药物用于治疗心血管相关疾病。5.一种筛选制剂的方法，所述制剂含有TIE2激酶抑制剂或者TIE2激酶激动剂，其特征在于，包括：使候选制剂与权利要求1或2所述诱导性多能干细胞接触，确定接触前后所述诱导性多能干细胞中TIE2基因的表达量，所述TIE2基因表达下调，是所述候选制剂作为含有TIE2激酶抑制剂的制剂的指示；所述TIE2基因表达上调，是所述候选制剂作为含有TIE2激酶激动剂的制剂的指示。6.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述的诱导性多能干细胞。7.一种获得权利要求1或2所述诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，包括：对所述脐动脉内皮细胞进行重编程，以便获得所述诱导性多能干细胞；任选地，获得所述脐动脉内皮细胞的步骤包括：将填充有Ⅳ型胶原酶溶液的脐带动脉血管进行孵育，收集所得到的消化液中的脐动脉内皮细胞；任选地，所述Ⅳ型胶原酶溶液浓度为0.5～3mg/mL，所述孵育时间为10～20分钟；任选地，所述步骤包括：除去脐带的脐动脉血管内残血，并向所得到的血管内填充1mg/mL的Ⅳ型胶原酶溶液；封住所述血管两端，在CO2气氛中37℃孵育15分钟，收集血管内的消化液；将所述消化液进行离心，弃上清，用EGM-2培养基重悬细胞，并将所得到的细胞悬液按5照1～5×10个细胞/孔接入孔板，在CO2气氛中37℃孵育，隔天更换培养基，当细胞生长至80～90％细胞汇合时，PBS洗涤细胞一次，用0.25％Trypin-EDTA在37℃消化3～5min，用EGM-2培养基终止消化后，将细胞从所述培养基上吹打下来，收集细胞于15ml离心管中，室温下以2CN110577967A权利要求书2/2页1000rpm的转速离心5min，弃上清，以便得到所述脐动脉内皮细胞；任选地，所述重编程包括将携带有重编程因子的仙台病毒转染至所述脐动脉内皮细胞中。8.一种生血内皮细胞，其特征在于，是由权利要求1或2所述诱导性多能干细胞分化得到