一种人源化纳米抗体及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110642946A(43)申请公布日2020.01.03(21)申请号201910939111.1(22)申请日2019.09.30(71)申请人中国药科大学地址210009江苏省南京市鼓楼区童家巷24号(72)发明人纪雪梅刘煜赵明军(74)专利代理机构南京经纬专利商标代理有限公司32200代理人唐循文(51)Int.Cl.C07K16/24(2006.01)权利要求书2页说明书7页序列表6页附图10页(54)发明名称一种人源化纳米抗体及其制备方法(57)摘要本发明涉及生物医药领域，具体公开了一种抗TNFα纳米抗体的人源化改造方法，本发明公开的人源化改造的抗TNFα纳米抗体核苷酸序列如SEQ.ID.NO.11所示，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.12；其改造方法包括以下步骤：确定FR2区三种关键氨基酸单突变与联合突变，核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1，3，5，7，9所示，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2，4，6，8，10所示；进一步多重序列对比确定人源化方案；通过上述得到人源化抗TNFα纳米抗体；经酵母表达系统表达。本发明改造的人源化抗TNFα纳米抗体，能保留较高的抗原亲和力，热稳定性以及生物活性，为今后人源化纳米抗体的疾病治疗药物的开发奠定基础。CN110642946ACN110642946A权利要求书1/2页1.一种人源化抗TNFα纳米抗体，其特征在于，所述人源化抗TNFα纳米抗体的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.11所示。2.根据权利要求1所述的一种人源化抗TNFα纳米抗体，其特征在于，编码人源化抗TNFα纳米抗体的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.12所示。3.根据权利要求1所述的一种人源化抗TNFα纳米抗体制备方法，其特征在于，包括以下步骤:1)通过IMGT抗体CDRs区Numbering方案，对抗TNFα纳米抗体的CDRs与FR进行分区；2)将对CDR3构象有影响的FR2骨架区的第42，50以及52位关键氨基酸进行不同组合突变，突变TNFα纳米抗体的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1，3，5，7，9，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2，4，6，8，10，确定50和52位氨基酸共突变对构象影响不大；3)将抗TNFα纳米抗体NbTNFα通过IgBLAST进行序列相似性搜索，搜索出与其序列同源性较高的人抗体胚系基因序列，并利用MEGA5.0软件对抗TNFα纳米抗体与人抗体胚系基因序列进行多重序列对比；4)人源化方案的制定：根据步骤2)和3)的分析结果，对抗TNFα纳米抗体进行合理的人源化设计，按如下进行设计：4.根据权利要求3所述的一种人源化抗TNFα纳米抗体制备方法，其特征在于通过酵母2CN110642946A权利要求书2/2页表达载体进行诱导表达，纯化后获得人源化抗TNFα纳米抗体。3CN110642946A说明书1/7页一种人源化纳米抗体及其制备方法技术领域[0001]本发明属于纳米抗体，具体涉及一种抗TNFα纳米抗体(NbTNFα)的人源化方法及其制备。背景技术[0002]肿瘤坏死因子α(TNFα)是一种研究最热门的多效应细胞因子，主要由活化的巨噬细胞分泌，同时淋巴细胞、可扑弗氏细胞、平滑肌细胞以及黑色素瘤、乳腺癌等多种肿瘤细胞也可以分泌。它不仅是炎症反应的关键介质，同时也可以通过调节信号转导引起细胞的凋亡与坏死。最近有新的研究发现，靶向TNFα的阻断剂在治疗相关疾病时，会引起糖尿病，银屑病，多发性硬化症等多种自身免疫疾病。另外，更多的研究也发现TNFα与肿瘤之间有着密切的关系，一方面低浓度的TNFα可以通过多种信号途径参与肿瘤的发生发展，另一方面高浓度的TNFα具有较强的抗肿瘤作用。目前对于TNFα的研究越来越深入，同时TNFα作为最成熟的靶点。目前已经多种TNFα抗体药物上市，其中包括三个进口(类克、恩利、修美乐)，三个国产(益赛普、强克、安百诺)。[0003]纳米抗体(nanobody)是一种特殊的小分子抗体，是从骆驼血清中分离出的一种缺失轻链和CH1恒定区的重链抗体，通过克隆其可变区可得到重链单域抗体(variabledomainoftheheavy-chainofheavy-chainantibody,VHH)即纳米抗体。它作为一种小分子抗体，具有传统抗体不具备的优势，1)分子量小，仅为15Kd，是传统单抗的1/10，具有强而快的穿透力，极易于穿过血管或组织到达靶部位，同时由于其能穿透血脑屏障，为脑部给药提供了新方法；2)稳定性好，研究发现，将纳米抗体放置在37℃一周以上，发现其仍然能保持80％以上的抗原结合能力，而单链抗体却发生了聚集与失活；同时有人将纳米抗体与单抗长期放置在90℃以及强变性剂下，发现纳米抗体仍保持很高的