一种纳米抗体人源化的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111635457A(43)申请公布日2020.09.08(21)申请号202010440008.5(22)申请日2020.05.22(71)申请人上海药明生物医药有限公司地址201403上海市奉贤区岚丰路1150号1幢2481室(72)发明人俞玲陆晓峰雷鸣(74)专利代理机构上海浦一知识产权代理有限公司31211代理人戴广志(51)Int.Cl.C07K16/00(2006.01)C12N15/13(2006.01)C12N15/10(2006.01)C12N15/70(2006.01)C40B50/06(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图2页(54)发明名称一种纳米抗体人源化的方法(57)摘要本发明公开一种纳米抗体人源化的方法，本方法利用带有回复突变位点的引物之间的重叠序列搭桥进行重叠PCR，以实现扩增人源化可变区全长突变文库序列，构建抗体人源化回复突变文库，随后进行表达并筛选出高亲和力分子。这种方法操作简单，并尽可能多将所有突变组合在文库里，以利后续对文库的突变体进行筛选，保留经过筛选且合适的人源序列，降低免疫反应，又能够最大限度的保留其特异性和亲和力，从而达到合理的人源化的效果。CN111635457ACN111635457A权利要求书1/1页1.一种纳米抗体人源化的方法，其特征在于，包括步骤：a.将通用性人源化纳米抗体框架的互补决定区CDR替换为抗体株纳米抗体的互补决定区CDR，对所述对抗体株纳米抗体的框架区FR与所述通用性人源化纳米抗体框架不同的氨基酸，进行回复突变；b.通过重叠PCR并采用带有回复突变位点的引物对所述回复突变点进行随机组合以构建点回复突变文库；c.通过第二轮PCR在所述点回复突变文库片段两端引入表达载体开口端重叠片段；d.将所述点回复突变文库连接表达载体，转化至表达菌株并诱导表达以获得表达产物；e.筛选高亲和力分子。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述通用性人源化纳米抗体框架为h-NbBcII10FGLA。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中所述重叠PCR的循环参数为：95℃预变性10秒，95℃变性10秒，50℃-68℃引物退火10秒，68℃引物延伸，循环28次后，最后68℃延伸2分钟。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中所述第二轮PCR的循环参数为：95℃预变性10秒，95℃变性10秒，50℃-68℃引物退火10秒，68℃引物延伸，循环28次后，最后68℃延伸2分钟。5.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述表达菌株为E.coliBL21(DE3)。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤d中，所述表达载体电转化至所述表达菌株。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤d中，诱导表达为在ZYM-5052培养基中低温诱导表达48小时。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤e中，通过取所述表达产物的上清液通过ELISA检测筛选高亲和力分子。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述ZYM-5052培养基中包括抗生素Carb。2CN111635457A说明书1/5页一种纳米抗体人源化的方法技术领域[0001]本发明涉及分子生物学中抗体人源化设计研究领域，包括分子生物学，生物化学，抗体蛋白结构预测和模拟，具体涉及一种利用带有点回复突变位点的引物的相互重叠区域搭桥的PCR进行纳米抗体人源化回复突变文库建立的方法。背景技术[0002]最早用于单克隆抗体人源化改造的方法是构建嵌合抗体[1]。该方法是将鼠源抗体的可变区和人抗体恒定区通过基因工程技术连接起来，即将鼠源抗体的恒定区基因替换为人抗体恒定区基因，与抗原结合的可变区部分仍然是鼠源抗体。此方法构建出的工程化嵌合抗体最大限度的保留了识别靶抗原能力的鼠源抗体可变区，同时又拥有了人抗体所有的恒定区的免疫学杀伤效应，而且由于这种嵌合抗体的免疫原性相比原始的鼠源抗体降低了2/3，所以可以应用于人体治疗[2]。但由于其分子中还保留1/3的鼠源部分,用于长期临床治疗还有可能发生人抗鼠抗体反应。因此，为了进一步降低嵌合抗体的免疫原性，需要对嵌合抗体的鼠源可变区进行进一步的人源化改造，获得全人源化抗体。[0003]目前应用较多的全人源化方法是将鼠源抗体可变区内参与抗原结合的部分与选择用于做模板的人抗体可变区的框架区重新拼接，使抗体可变区中除高度可变的互补决定区(CDR)来源于鼠抗体外，其余部分都换成人源的。由于抗体可变区中参与抗原结合的一般是其6个互补决定区(CDR)，故此过程也被称为“特异性和亲和力”。为了克服由于“CDR移植”可能导致的亲和力下降，需通过一系列对框架区残基的突变，逐步恢复或提高抗体的抗原结