一种烯酰吗啉半抗原及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111138381A(43)申请公布日2020.05.12(21)申请号201911360335.3(22)申请日2019.12.25(71)申请人国家海洋环境监测中心地址116023辽宁省大连市沙河口区凌河街42号(72)发明人王睿睿(74)专利代理机构大连理工大学专利中心21200代理人温福雪(51)Int.Cl.C07D295/185(2006.01)C07K14/765(2006.01)C07K14/77(2006.01)C07K16/44(2006.01)G01N33/577(2006.01)权利要求书3页说明书7页附图1页(54)发明名称一种烯酰吗啉半抗原及其制备方法和应用(57)摘要本发明涉及生物技术领域，公开了一种烯酰吗啉半抗原及其制备方法和应用。本发明提供的烯酰吗啉半抗原既最大程度地保留了烯酰吗啉的化学结构，又通过化学合成，引入了可以与蛋白质偶联的含氮基团，合成方法简单，产物纯度、得率较高；使用该半抗原作为原料制备适合动物免疫的抗原体系，制备的单克隆抗体特异性、亲和力、抗体效价均较好，可用于制备酶联免疫试剂盒，检测成本低、检测方法快速、高效、准确，适用于蔬菜、水果中烯酰吗啉残留的现场监控和大量样本筛查。CN111138381ACN111138381A权利要求书1/3页1.一种烯酰吗啉半抗原，其特征在于，其分子结构式如下式I所示：2.一种制备如权利要求1所述的烯酰吗啉半抗原的制备方法，其包括以下步骤：步骤1)以无水乙醇为溶剂，对硝基苯甲酰氯:氯苯:三氯化铝摩尔比为1:1-4.5:1-3，反应温度为75℃，反应时间为1.5h；反应液变粘稠，红棕色，停止反应，加入2M硫酸水溶液处理，抽滤、水洗，将滤饼加入稀氢氧化钠溶液中，加热搅拌，水洗至中性，干燥得黄色粗产品；经热95％乙醇溶解、过滤、重结晶得白色固体即产物1，步骤2)采用四氢呋喃溶解膦酰基乙酸三乙酯，冰盐浴控温4℃，分批加入，0.6g的氢化钠，室温反应1h；之后加入步骤1)所得产物1的四氢呋喃溶液，滴毕后，40℃反应5h，TLC显示反应完毕，再加入水，静置分层，水层用乙酸乙酯萃取，合并有机相，稀盐酸洗涤后经过无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸除溶剂，剩余黄色油装物中加入乙醇50mL，加热溶解后冷却析晶，过滤，滤饼用冷乙醇洗涤，60℃干燥得黄色固体即为产物2；其中，膦酰基乙酸三乙酯、氢化钠和产物1的摩尔比为1:0.8-1.2:0.6-1.5，步骤3)取步骤2)中所得产物2，采用无水乙醇溶解，室温下加入氢氧化钠，搅拌反应2h；反应结束后加水，用盐酸溶液酸化，乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，脱溶得白色固体，即产物3，2CN111138381A权利要求书2/3页步骤4)取步骤3)中所得产物3，二环己基碳二亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺溶解在乙酸乙酯中，室温搅拌反应8h，离心去沉淀，向上清液中加入吗啉，搅拌反应3h；反应结束后，用水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发去除乙酸乙酯，得产物4；其中，产物3、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和吗啉的摩尔比1:0.8-2:0.8-2:0.5-2，步骤5)称取铁粉，加入到90℃盐酸的水溶液中，不断搅拌，1h后，加入步骤4)所得产物4，加热到95℃，反应4h，调节pH在8-9，然后加入活性炭继续搅拌40min，趁热过滤，滤液倒入烧杯中冷却结晶，滤饼用热的乙醇洗涤三次合并滤液，然后倒入冷水中，晶体自然析出；得淡黄色固体，真空干燥，称重，得固体，即为烯酰吗啉半抗原，3.根据权利要求2所述的制备如权利要求1所述的烯酰吗啉半抗原的制备方法，其中，在步骤1)中，对硝基苯甲酰氯、氯苯和三氯化铝的摩尔比为1:2-3:1-2，优选为1:2.5:1.5；在步骤2)中，膦酰基乙酸三乙酯、氢化钠和产物1的摩尔比为1:0.9-1.1:0.8-1.1，优选为1:1:0.92；在步骤4)中，产物3、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和吗啉的摩尔比为1:0.9-1.5:0.9-1.5:0.9-1.5，优选为1:1.2:1.2:1。4.一种烯酰吗啉抗原，其特征在于，其通过权利要求1所述的烯酰吗啉半抗原或权利要求2或3所述的方法制备的烯酰吗啉半抗原与载体蛋白交联获得，所述的载体蛋白选自：牛血清白蛋白或鸡卵白蛋白。5.一种制备如权利要求4所述的烯酰吗啉抗原的制备方法，其包括如下步骤：步骤1)取权利要求1所述的烯酰吗啉半抗原或权利要求2或3所述的方法制备的烯酰吗啉半抗原50mg用稀盐酸溶解，滴加1.5％亚硝酸钠溶液，冰浴下持续搅拌；溶液变成蓝黑色后，停止加入亚硝酸钠溶液，继续反应15min；步骤2)滴加到浓度为10-20mg/mL的载体蛋白溶液，搅拌，调节pH至10，2-8℃下反应3h，透析3天