一种载纤连蛋白多孔支架增加干细胞体内留存时间的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111793601A(43)申请公布日2020.10.20(21)申请号202010551628.6(22)申请日2020.06.17(71)申请人天津市康婷生物工程集团有限公司地址300200天津市西青区经济技术开发区赛达南道9号(72)发明人程国钢赵刚卢君君邢紫钧王倩马洁(74)专利代理机构天津盛理知识产权代理有限公司12209代理人刘丹舟(51)Int.Cl.C12N5/0775(2010.01)权利要求书1页说明书5页附图3页(54)发明名称一种载纤连蛋白多孔支架增加干细胞体内留存时间的方法(57)摘要本发明涉及一种载纤连蛋白多孔支架增加干细胞体内留存时间的方法，提供了一种载纤连蛋白的多孔支架的制备方法，通过此方法制备的支架孔隙率可达45％，孔‑孔相连，使得支架细胞相容性高、细胞毒性低。利用此支架建立一种载纤连蛋白多孔支架增加干细胞体内留存时间的方法，此支架是全程处于温和、低温、无失活剂存在等条件下制备而成的，在保证了蛋白的活性的同时，还可持续的释放纤连蛋白以提供细胞在支架上的的黏连，增加干细胞的体内留存时间，为干细胞向成骨细胞分化提供了充足的时间和理论的“巢穴”，为开发制备最优骨缺损移植物提供了技术基础。CN111793601ACN111793601A权利要求书1/1页1.一种载纤连蛋白多孔支架增加干细胞体内留存时间的方法，其特征在于：方法步骤如下：⑴慢病毒Fluc-RFP转染脐带间充质干细胞：将融合度达到50％的UC-MSCs，使用DMEM/HAM’SF-12培养基和慢病毒Fluc-RFP的混合液进行换液，24小时后使用DMEM/HAM’SF-12完全培养基进行换液，继续培养48小时后观察转染效率；⑵UC-MSCs-Fluc-RFP细胞的接种与体内留存时间的测定：将上述细胞浓缩液接种到已经灭菌的载纤连蛋白多孔支架上，室温静置20min，加入完全培养基培养16h后采用生物发光法测定支架上的生物发光信号而后挑选强度相近的进行裸鼠的皮下移植手术；⑶手术完成2h后进行小鼠体内留存时间测定，记录为1day，并连续测定40天进行定性和定量分析。2.根据权利要求1所述的一种载纤连蛋白多孔支架增加干细胞体内留存时间的方法，其特征在于：所述步骤⑴中慢病毒Fluc-RFP的质粒含有荧光素酶Fluc和红色荧光蛋白RFP两种基因。3.根据权利要求1所述的一种载纤连蛋白多孔支架增加干细胞体内留存时间的方法，其特征在于：所述步骤⑵中接种UC-MSCs-Fluc-RFP细胞个数为1X105个，总体积为20ul。4.根据权利要求1所述的一种载纤连蛋白多孔支架增加干细胞体内留存时间的方法，其特征在于：所述的载纤连蛋白多孔支架的制备方法，体制备方法步骤如下：⑴利用乳化法制备粒径在200-400μm的PLGA微球；⑵将磷酸四钙Ca4(PO4)2O和无水磷酸氢钙CaHPO4粉末进行混合制备成CPC粉末，其中Ca4(PO4)2的摩尔分数为33-50％，CaHPO4的摩尔分数为77-50％；⑶混合支架的制备：将CPC粉末与无菌PBS按照10g：3mL调和均匀后，与PLGA微球混合均匀后迅速填入到Φ5mm×5cm的不锈钢磨具中，一端磨平室温静置2min后脱模，迅速转移至-80℃冰箱预冻8h，完全冷冻后进行冷冻干燥48小时，即得到混合支架；⑷多孔支架的制备及灭菌：使用4℃丙酮浸泡混合支架，依次用冷无水乙醇、冷无菌水、冷无菌PBS清洗，干燥后用紫外灯进行灭菌待用；⑸纤连蛋白缓释：将支架浸渍在PBS中，置于摇床上，在预定的时间点取出1mlPBS，并及时补充1ml新鲜PBS，待收集完毕时，将收集的清液用纤连蛋白检测试剂盒进行定量分析，并绘制纤连蛋白的释放曲线。5.根据权利要求4所述的一种载纤连蛋白多孔支架增加干细胞体内留存时间的方法，其特征在于：所述步骤⑶所述的无菌PBS为PBS或纤连蛋白与PBS的混合溶液，其中纤连蛋白的浓度为0.1mg/ml，PLGA微球与CPC粉末的重量比为1：10。6.根据权利要求4所述的一种载纤连蛋白多孔支架增加干细胞体内留存时间的方法，其特征在于：所述步骤⑸中的预定时间点设定为1、2、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72天。7.根据权利要求4所述的一种载纤连蛋白多孔支架增加干细胞体内留存时间的方法，其特征在于：所述步骤⑶所述的无菌PBS为如cRGD、牛血清蛋白BSA的PBS溶液。2CN111793601A说明书1/5页一种载纤连蛋白多孔支架增加干细胞体内留存时间的方法技术领域[0001]本发明属于生物医用材料领域，涉及载纤连蛋白多孔支架，尤其是一种载纤连蛋白多孔支架增加干细胞体内留存时间的方法。背景