一种重组纤连蛋白肽的纯化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114409763A(43)申请公布日2022.04.29(21)申请号202111559558.XC12R1/19(2006.01)(22)申请日2022.03.15(71)申请人湖南华腾制药有限公司地址410013湖南省长沙市岳麓区麓谷企业广场E1栋(72)发明人唐建军张径唐香华(51)Int.Cl.C07K14/78(2006.01)C12N15/12(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12N1/21(2006.01)C07K1/18(2006.01)A61K8/64(2006.01)A61Q17/04(2006.01)A61Q19/00(2006.01)权利要求书1页说明书6页A61Q19/08(2006.01)序列表3页附图2页(54)发明名称一种重组纤连蛋白肽的纯化方法(57)摘要本发明涉及一种重组纤连蛋白肽的纯化方法，属于生物医药领域。所述纯化方法采用大肠杆菌作为表达系统，不添加标签蛋白或其他氨基酸，氨基酸序列与人纤连蛋白氨基酸序列一致，进行纯化；其中，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)；该方法与现有技术相比，具有生长周期短，纯化步骤简单，高纯度，高收率，低成本，适用于工业放大生产的特点。CN114409763ACN114409763A权利要求书1/1页1.一种重组纤连蛋白肽的纯化方法，包括，采用大肠杆菌作为表达系统，不添加标签蛋白或其他氨基酸，氨基酸序列与人纤连蛋白氨基酸序列一致，进行纯化；其中，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。2.根据权利要求1中所述的纯化方法，其包括如下步骤：步骤1：合成纤连蛋白的Ⅲ‑8、Ⅲ‑9、Ⅲ‑10和Ⅲ‑12、Ⅲ‑13、Ⅲ‑14序列；步骤2：将步骤1中的纤连蛋白转化成pET‑27b(+)载体；步骤3：将构建好的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)并筛选高表达菌株；步骤4：筛选步骤3中的高表达菌株后进行高密度发酵、离心收集菌体、高压破菌后收集上清液；步骤5：往步骤4中的上清液中加入中性盐进行盐析，得到初纯样品；步骤6：将步骤5中的初纯样品用缓冲液溶解后进行纯化，所述的纯化包括：采用阴离子交换层析填料进行纯化，纯化的洗脱液为磷酸盐缓冲液和氯化钠混合溶液；步骤7：收集步骤6中的洗脱液，得到高纯度的纤连蛋白原液。3.根据权利要求2中所述的纯化方法，步骤5中所述的中性盐选自硫酸铵、硫酸钠和氯化钠中至少的一种。4.根据权利要求3中所述的纯化方法，步骤5中所述的中性盐水溶液的浓度为0.3mol/L至1.5mol/L。5.根据权利要求2中所述的纯化方法，步骤5中所述的中性盐为硫酸铵，所述硫酸铵水溶液的浓度为0.3mol/L至1.5mol/L。6.根据权利要求2中所述的纯化方法，所述步骤6中的缓冲液为磷酸盐缓冲液。7.根据权利要求6中所述的纯化方法，所述磷酸盐缓冲液浓度为10mmol/L至50mmol/L的磷酸盐缓冲液。8.根据权利要求2中所述的纯化方法，所述步骤6中的缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的PH值为6.5至7.5。9.根据权利要求2中所述的纯化方法，所述步骤6中的洗脱液为磷酸盐和氯化钠的混合溶液，其中，磷酸盐浓度为10mmol/L至50mmol/L，氯化钠浓度为0.3mol/L至1.0mol/L。10.根据权利要求2中所述的纯化方法，所述步骤6中的阴离子交换层析的填料选自QSepharoseFastFlow和DEAESepharoseFastFlow中的一种。2CN114409763A说明书1/6页一种重组纤连蛋白肽的纯化方法技术领域[0001]本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种重组纤连蛋白肽的纯化方法。背景技术[0002]纤连蛋白(Fibronectin，FN)是一种巨大糖蛋白，分子量约为250kDa(单体)，它广泛存在于血浆、多种细胞表面及细胞基质中，在细胞与细胞之间、细胞与基质之间的相互作用中发挥极其重要的功能。[0003]纤连蛋白由两个几乎相同的单体通过一对二硫键连接而成。每一个纤连蛋白亚基的分子量为230‑250kDa，它们由三种重复的模块(modularstructures)组成，以上各种模块组成了纤连蛋白的功能性结构域。其中，第一、第二和第三重复序列(此后分别称为III‑1、III‑2和III‑3)包含在自缔合结构域中，第四、第五和第六重复序列(此后分别称为III‑4、III‑5和III‑6)包含在DNA结合结构域中，第八、第九和第十重复序列(此后分别称为III‑8、III‑9和III‑10)包含在细胞结合结构域中，和第十二、第十三和第十四重复序列(此后分别称为III‑12、III‑13和III‑14)包含在肝素结合结构域中。[0004]现有技术中，重组纤