吡唑醚菌酯半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111961002A(43)申请公布日2020.11.20(21)申请号202010902312.7(22)申请日2020.09.01(71)申请人北京望尔生物技术有限公司地址102206北京市昌平区回龙观国际信息产业基地高新四街8号申请人北京勤邦生物技术有限公司(72)发明人王兆芹万宇平何方洋马玉华张瑜崔娜凡静静(51)Int.Cl.C07D231/22(2006.01)C07K14/765(2006.01)C07K14/77(2006.01)C07K14/795(2006.01)C07K16/44(2006.01)G01N33/53(2006.01)G01N33/577(2006.01)权利要求书2页说明书6页附图1页(54)发明名称吡唑醚菌酯半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了吡唑醚菌酯半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用，本发明提供的吡唑醚菌酯半抗原既最大程度保留了吡唑醚菌酯的特征结构，使得吡唑醚菌酯半抗原的免疫原性明显增强，又具有可以与载体蛋白发生偶联的羧基；用吡唑醚菌酯半抗原与载体蛋白偶联后得到的吡唑醚菌酯人工抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体，经检测吡唑醚菌酯抗体的灵敏度可达0.1μg/L，与其他甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的交叉反应率低，为后续建立吡唑醚菌酯的各种免疫分析方法提供了基础。CN111961002ACN111961002A权利要求书1/2页1.一种吡唑醚菌酯半抗原，其特征在于，其具有如下结构式：2.如权利要求1所述的吡唑醚菌酯半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)在碱性条件下，将甲基2-(溴甲基)-4-碘苯(甲氧基)氨基甲酸酯与1-(4-氯苯基)-2H-吡唑啉-3-酮进行亲核取代反应得到中间体1，所述中间体1具有结构式2)在碱性条件下，将所述中间体1与氨基丁酸发生亲核取代反应，得到吡唑醚菌酯半抗原。3.如权利要求2所述的吡唑醚菌酯半抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤1)包括如下步骤：所述碱性条件由KOH提供，所述甲基2-(溴甲基)-4-碘苯(甲氧基)氨基甲酸酯、1-(4-氯苯基)-2H-吡唑啉-3-酮、KOH的物质的量之比为1:1:2；所述反应在溶剂中进行，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；所述反应条件为：油浴加热80℃反应7h；所述步骤1)反应结束后，还包括对反应体系进行后处理的步骤，具体如下：将反应体系冷却到室温，加入水，加乙酸乙酯萃取，有机相水洗后蒸干获得中间体1。4.如权利要求2所述的吡唑醚菌酯半抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤2)包括如下步骤：所述碱性条件由氢化钠提供，所述中间体1、氨基丁酸、氢化钠的物质的量之比为1:1:2；所述反应在溶剂中进行，所述溶剂为二甲基亚砜；所述反应条件为：100℃反应9h；所述步骤2)反应结束后，还包括对反应体系进行后处理的步骤，具体如下：将反应体系冷却到室温，加入水，用盐酸调节pH至5，加乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，水洗，旋蒸浓缩，上硅胶柱，用石油醚和乙酸乙酯体积比为3:1的混合溶剂洗脱分离获得吡唑醚菌酯半抗原。5.一种吡唑醚菌酯人工抗原，其特征在于，其是载体蛋白和权利要求1所述的吡唑醚菌酯半抗原偶联得到的偶联物。6.如权利要求5所述的吡唑醚菌酯人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白。2CN111961002A权利要求书2/2页7.一种吡唑醚菌酯抗体，其特征在于，它是由权利要求5所述的吡唑醚菌酯人工抗原经动物免疫得到，其能与吡唑醚菌酯发生特异性免疫反应。8.一种权利要求7所述的吡唑醚菌酯抗体在检测吡唑醚菌酯残留中的应用。3CN111961002A说明书1/6页吡唑醚菌酯半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于食品安全检测领域。更具体地，本发明涉及吡唑醚菌酯半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用。背景技术[0002]吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)，又名唑菌胺酯，是一种新型广谱甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，具有杀菌谱广、活性高、持效期长、毒性低、对非靶标生物安全等特点，主要用于防治果蔬等作物上由子囊菌纲、担子菌纲、半知菌纲和卵菌纲真菌引起的叶枯病、锈病、白粉病、霜霉病、疫病、炭疽病、疮痂病、褐斑病、立枯病、稻瘟病等多种病害。我国国家标准GB2763-2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定了不同食品中吡唑醚菌酯的残留限量。[0003]目前，国内外检测吡唑醚菌酯主要采用气相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱串联质谱法等分析方法，存在样品前处理繁琐、检测时间长、仪器贵重等缺点，所以在我国无法得到广泛应用，并且不符合