一种鸡传染性贫血病病毒绝对荧光定量PCR检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112522447A(43)申请公布日2021.03.19(21)申请号202011574377.X(22)申请日2020.12.28(71)申请人扬州大学地址225009江苏省扬州市大学南路88号(72)发明人叶建强张俊马莉李拓凡万志敏邵红霞秦爱建(74)专利代理机构扬州苏中专利事务所(普通合伙)32222代理人沈志海(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/6851(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表1页附图5页(54)发明名称一种鸡传染性贫血病病毒绝对荧光定量PCR检测方法(57)摘要本发明涉及一种鸡传染性贫血病病毒绝对荧光定量PCR检测方法，科学地设计特异扩增鸡传染性贫血病病毒病毒VP1基因片段的引物，然后通过使用TaKaRa公司的TBGreen™PremixExTaq™II试剂来进行绝对荧光定量PCR方法的建立。根据鸡传染性贫血病病毒VP1基因的高度保守区，科学设计并合成了扩增片段大小为140bp的上下游引物，引物序列如下：上游引物为VP1‑F：5′‑GCCCCGGTACGTATAGTGTG‑3′；下游引物为VP1‑R：5′‑CCCGTACATGTGGTCTGCAT‑3′；本发明可用于企业对鸡传染性贫血病病毒疫苗污染残留及临床样品中低含量鸡传染性贫血病病毒的快速且特异的检测；可通过定量检测鸡传染性贫血病病毒含量情况，从而了解鸡传染性贫血病病毒在体内的变化规律等，为进一步探究鸡传染性贫血病病毒的分子生物学特征及制定有效防控策CN112522447A略提供了有效手段。CN112522447A权利要求书1/1页1.一种鸡传染性贫血病病毒绝对荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）鸡传染性贫血病病毒基因组DNA的提取：鸡传染性贫血病病毒基因组DNA的提取通过使用Axygen公司的DNA小提试剂盒AxyPrepTMMultisourceGenomicDNA完成；（2）引物的设计与合成：根据鸡传染性贫血病病毒VP1基因的高度保守区，设计并合成了扩增片段大小为140bp的上下游引物，引物序列如下：上游引物为VP1‑F：5′‑GCCCCGGTACGTATAGTGTG‑3′；下游引物为VP1‑R：5′‑CCCGTACATGTGGTCTGCAT‑3′；引物使用前，用超纯水溶解，使用浓度为10pmol，‑20℃保存备用；（3）绝对荧光定量PCR方法的建立：通过使用TaKaRa公司的TBGreen™PremixExTaq™II试剂来进行绝对荧光定量PCR方法的建立，反应体系为20μL：A液：模板2μL，双蒸水6μL；B液：TBGreenPremixExTaqII（2×）10μL，上下游引物各0.8μL，ROXReferenceDyeⅡ（50×）0.4μL；加样时先在八联管反应管里加入B液，后加A液，上机前离心处理；反应程序如下：先95℃预变性30s，然后95℃变性5s，最后60℃退火34s，反应程序共40个循环；（4）标准曲线的绘制：将实验室已经成功制备的pcDNA3.1‑VP1质粒作为阳性标准品备用；将阳性标准品质粒换算拷贝数后，进行连续的10倍倍比稀释，从1∶10到1∶109共设置9个浓度梯度，每个梯度设置3个重复，于ABI7500型荧光定量PCR仪中进行扩增，同时设置去离子水为阴性对照；扩增结束后收集数据，根据扩增曲线图、CT值情况，得出最佳的检测区域，并绘制标准曲线；（5）绝对荧光定量PCR方法的灵敏度和特异性试验：通过标准曲线的绘制显示可检测到仅含10个病毒DNA拷贝数的鸡传染性贫血病病毒，体现出绝对荧光定量PCR方法的灵敏度；将实验室已有的禽腺病毒FAdV、禽白血病病毒ALV和网状内皮组织增生症病毒REV提取相应核酸，按照扩增体系运行程序；同时设鸡传染性贫血病病毒阳性对照及去离子水的阴性对照，检测结果体现出绝对荧光定量PCR方法的特异性。2CN112522447A说明书1/4页一种鸡传染性贫血病病毒绝对荧光定量PCR检测方法技术领域[0001]本发明涉及一种鸡传染性贫血病病毒绝对荧光定量PCR检测方法，属于生物技术领域。背景技术[0002]鸡传染性贫血病病毒（ChickenInfectiousAnemiaVirus，CIAV）感染主要引起雏鸡障碍性贫血及全身性淋巴组织萎缩；成年鸡感染鸡传染性贫血病病毒后常呈亚临床带毒，导致生产性能以及免疫功能下降。鸡传染性贫血病病毒既能水平传播，又能垂直传播。自1979年首次报道以来，鸡传染性贫血病病毒已蔓延至世界各地。我国于1992年首次在黑龙江省分离到鸡传染性贫血病病毒，随后在河南、山东、江苏