一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107099617A(43)申请公布日2017.08.29(21)申请号201710184165.2(22)申请日2017.03.24(71)申请人河北农业大学地址071001河北省保定市灵雨寺街289号(72)发明人张铁陈谏王春光孟凡国张广群蒋桂娥贾书芬贾泽张石磊(74)专利代理机构石家庄国为知识产权事务所13120代理人申超平(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)权利要求书2页说明书4页附图1页(54)发明名称一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法(57)摘要本发明公开了一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR（real-timePCR）检测方法，涉及分子生物学领域，本发明针对鸡传染性喉气管炎病毒的gB基因设计并合成了一对引物PF：5′-CAATGGCTTCGGAGAAAGAG-3′和PR：5′-GGCAATCCTGATCCCATCTA-3′，经PCR扩增和标准品制备，建立检测鸡传染性喉气管炎病毒的荧光定量PCR方法，具有特异性更强，灵敏度高，操作简单快速，对PCR进程进行实时检测，对每一个循环进行定量和定性分析，并可利用建立的鸡传染性喉气管炎病毒的荧光定量PCR方法检测出组织内的病毒含量。CN107099617ACN107099617A权利要求书1/2页1.一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤：（1）引物设计：针对鸡传染性喉气管炎病毒的gB基因设计并合成了一对引物PF和PR，上游引物PF为5′-CAATGGCTTCGGAGAAAGAG-3′，下游引物PR为5′-GGCAATCCTGATCCCATCTA-3′；（2）传统PCR扩增：首先对提取出对鸡传染性喉气管炎病毒DNA进行传统PCR扩增，通过预变性、变性、退火、延伸步骤，快速特异地在体外扩增出目的DNA片段；（3）阳性标准品制作：将目的DNA片段连接入载体，转入感受态细胞，构建重组质粒作为阳性标准品；（4）荧光定量PCR检测：用梯度稀释的质粒标准品进行real-timePCR扩增，得到扩增曲线，并以拷贝数为x轴，以Ct值为y轴，构建real-timePCR标准曲线，建立检测鸡传染性喉气管炎病毒的荧光定量PCR方法；（5）对该引物进行了特异性和灵敏度检测。2.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（3）中所述阳性标准品制作的步骤为：将PCR产物与pUC19-T载体25℃条件下连接，转化于DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养，挑取单菌落，转于含有Amp的LB液体培养基中，37℃环境下，以200r/min振荡培养12h，提取重组质粒，测序，用微量紫外可见分光光度计测定浓度和纯度，根据摩尔定律，计算出单位体积质粒所含的DNA拷贝数浓度，依据计算出的拷贝数进行10倍梯度稀释，作为标准品。3.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（4）中所述荧光定量PCR检测的步骤为：用10倍梯度稀释的质粒标准品进行real-timePCR扩增，得到扩增曲线，并以拷贝数为x轴，以Ct值为y轴，构建real-timePCR标准曲线，建立检测鸡传染性喉气管炎病毒的荧光定量PCR方法。4.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（1）中所述gB基因GenBank登录号为EU104985。5.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（2）中所述传统PCR扩增的20μL的反应体系为：2×mix10μL、25μmol/μL上游引物PF0.5μL、25μmol/μL下游引物PR0.5μL、模板DNA2μL、ddH2O7μL。6.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（2）中所述反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸5min。7.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（4）中所述real-timePCR扩增的20μL的反应体系为：2×SYBRGreenⅠqPCRMasterMix10μL、25μmol/μL上游引物PF0.5μL、25μmol/μL下游引物PR0.5μL、模板DNA2μL、ddH2O7μL。8.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（4）中所述real-timePCR扩增的反应条件为：95℃预变性10min,95℃变性10s，