蛋白质含量测定方法比较.doc

蛋白质含量测定主要有五种方法,分别就是凯式定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、酚试剂法与考马斯亮蓝法。这五种方法各有特点,优缺点明确。
凯氏定氮法
蛋白质就是含氮得化合物。食品与浓硫酸与催化剂共同加热消化,使蛋白质分解,产生得氨与硫酸结合生成硫酸铵,留在消化液中,然后加碱蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后,再用盐酸标准溶液滴定,根据酸得消耗量来乘以蛋白质换算系数,即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外,还含有其它含氮物质,所以此蛋白质称为粗蛋白。
优点:重现性好,就是目前分析有机化合物含氮量常用得方法,就是一种蛋白质测定得经典方法,,测试结果准确。
缺点:操作比较繁复,费时,试剂消耗量大。且此法测定得蛋白质含量实际上包括了核酸,生物碱,含氮类脂,卟啉,含氮色素等非蛋白质含氮化合物。
双缩脲定氮法
双缩脲(NH3CONHCONH3)就是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到得产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接得肽键,或能过一个中间碳原子相连得肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色得深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定得物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液与某些氨基酸等。
优点:较快速,不同得蛋白质产生颜色得深浅相近,以及干扰物质少。主要得缺点就是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确得蛋白质测定。
缺点:不太灵敏;不同蛋白质显色相似。
紫外吸收定氮法
双缩脲法就是传统得分光光度法测定蛋白质得方法,当含有两个或者两个以上肽键得物质与碱性得硫酸铜反应时,形成紫色得络合物,这个颜色产物就是肽键中得氮原子与铜离子配价结合得结果。蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸与色氨酸残基得苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光得性质。形成颜色产物得量取决于蛋白质得浓度。实际测定时,必须预先用标准蛋白质溶液制作一个标准校正曲线,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白质标准溶液。不同浓度得标准蛋白质溶液加入双缩脲试剂后,反应生成得颜色产物用紫外可见分光光度计在540nm波长下测定吸光度,以双缩脲试剂加缓冲或水作空白对照。然后将测得得值分别对蛋白浓度(mg/ml)作图,得标准曲线。未知蛋白样品用双缩脲试剂做同样处理,根据测得吸光度值在标准曲线上直接查得未知蛋白质样品中得蛋白质浓度。
优点:对各种蛋白质呈色基本相同;特异性与准确度好,精密度好;呈色稳定性好,试剂单一,方法简便。快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。
缺点:准确度较差,干扰物质多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸与色氨酸含量差异大得蛋白质,有一定得误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似得蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光得物质,会出现较大得干扰。核酸得干扰可以通过查校正表,再进行计算得方法,加以适当得校正。但就是因为不同得蛋白质与核酸得紫外吸收就是不相同得,虽然经过校正,测定得结果还就是存在一定得误差。此外,进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因pH得改变而有变化,因此要注意溶液得pH值,测定样品时得pH要与测定标准曲线得pH相一致。
酚试剂法
此法得显色原理与双缩脲方法就是相同得,只就是加入了第二种试剂,即Folin—酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质得灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色得原因就是:在碱性条件下,蛋白质中得肽键与铜结合生成复合物。‚Folin—酚试剂中得磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中得酪氨酸与苯丙氨酸残基还原,产生深蓝色(钼兰与钨兰得混合物)。在一定得条件下,蓝色深度与蛋白得量成正比。
优点:灵敏度高,比双缩脲法灵敏约100倍。操作简单,不需要特殊仪器设备。
缺点:费时间较长,要精确控制操作时间,标准曲线也不就是严格得直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰得离子,同样容易干扰Lowry反应。而且对后者得影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低得尿素(0、5%),硫酸纳(1%),硝酸纳(1%),三氯乙酸(0、5%),乙醇(5%),乙醚(5%),丙酮(0、5%)等溶液对显色无影响,但这些物质浓度高时,必须作校正曲线。含硫酸铵得溶液,只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液,即可显色测定。若样品酸度较高,显色后会色浅,则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液得浓度1~2倍。进行测定时,加Folin—酚试剂时要特别小心,因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定,但上述还原反应只在pH=10得情况下发生,故当Folin一酚试剂加到碱性得铜—蛋白质溶液中时,必须立即混匀,以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前,还原反应即能